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流式細胞術常見問題集錦

 angelzhang69 2015-11-13



1、流式細胞儀上的FL2-W FL2-A FL2-H 分別是做什么的?


FL2-W是只檢測熒光的脈沖寬度, FL2-H是指脈沖高度。通常在做細胞周期分析時應用,用于去除粘連細胞。


2、流式同型對照怎樣選擇?


同型對照(IsotypeControl):使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白,用于消除由于抗體非特異性結合到細胞表面而產(chǎn)生的背景染色。如果一抗是多抗,可以用annormal serum(與一抗相同的正常血清) (must be the same species as primaryantibody)。This control is easy to achieve and can be used routinely inimmunohistochemicalstaining.這個可以咨詢試劑商。同型對照為免疫熒光標記中的陰性對照。由于熒光標記單抗的組來源不同,應選用相同來源的未標記單抗作為同型對照來調(diào)整背景染色。舉個例子:比如檢測一抗為單抗的mouseanti rat CD11b,clone OX-42 purified IgG,那么它的isotype 是mouse IgG2a,所以可以用purified(純化的) mouse IgG2a來做OX-42的同型對照(Isotype Control)。一般的的生物技術公司和國內(nèi)的代理都有出售。


同型對照:是指與MoAb相同的、未免疫小鼠的免疫球蛋白亞類,若使用直接免疫熒光染色法,同型對照也應標記熒光色素,如IgG1 FITC、IgG2a、PE等。主要考慮了細胞的自發(fā)熒光、FC受體介導的抗體結合和非特異性抗體結合等影響因素。此外,同型對照與MoAb所標記的熒光色素、濃度、F:P比值(標記的熒光色素與免疫球蛋白分子的比值)應該相同為最佳,這對準確設定陰性與陽性細胞的界標有重要意義,切忌使用與MoAb不相匹配的同型對照,最好為同一實驗室、采用相同工藝或方法制備(如同一品牌)的產(chǎn)品。


3、流式細胞技術測定細胞內(nèi)游離鈣濃度為何要使用氯化鈣?


在文獻及其他專業(yè)網(wǎng)站中都有測定游離鈣的方法,具體如下:


(1) 鈣熒光探針負載;


(2)隨機測定每管細胞懸液樣品(以下簡稱樣品)的單個細胞的熒光強度,記為F值。


(3)加入10%Triton X 100,(破膜用);加入1 mmol/L氯化鈣,(問題所在),吹打均勻,孵育1~10min,測定熒光即Fmax值。


(4)加入EGTA,20%26mu;l(鈣螯合劑),孵育1~10min,激發(fā)波長488nm測定熒光,即Fmin值。


這個過程中的氯化鈣的作用如何, 請高人指點, 謝謝。


因為正常血漿中Ca2+濃度是1mM,細胞外液的Ca2+對細胞內(nèi)Ca2+有影響。加0.1%triton是增加膜通透性,使細胞外Ca2+進入細胞內(nèi),作為最大值。加EGTA是為了螯合Ca2+,作為最小值.生理環(huán)境中細胞內(nèi)鈣離子濃度遠低于細胞外液(大約1:10000),細胞膜對鈣的通透性變化對細胞內(nèi)鈣影響很大。


4、流式與werstern的區(qū)別?


知道一些,不足之處請大家補充:


(1)Western 是檢測蛋白表達的金標準,可用于檢測細胞多種類型的蛋白;流式細胞術的方法多用于檢測細胞膜蛋白,雖然也可通過Triton-X100給細胞打孔的方法來檢測胞內(nèi)蛋白,但對于分泌蛋白卻是無能為力的;(2)Western測蛋白含量對抗體的量需要很少,一般1:1000左右,而流式對抗體的需要量很大,一般1:50(很浪費抗體);(3)采用Western方法檢測細胞蛋白含量的變化一般要有內(nèi)參,而流式一般要把每個樣品分為兩份,同時都做只加二抗(FITC標記的)的對照,這樣平均到每個細胞的發(fā)光就不用內(nèi)參了;(4)就個人經(jīng)驗而言,流式用多抗不好,單抗標出來不錯。


不過流式的應用原理主要還是抗原和抗體反應和western、免疫組化沒有本質差別,但是由于免疫組化和western都有酶催化底物的放大體系,因此,流式不適合檢測低表達的蛋白,低表達的還是采用western(尤其是化學發(fā)光底物更佳)和免疫組化更好。當然,流式最大的一個特點就是,可以定量(百分比),如果是高表達的用流式細胞儀非常有優(yōu)勢。


5、FL1, FL2, FL3 的區(qū)別是什么?


是指在不同位置測得的熒光?還是不同波長的熒光?這3個參數(shù)到底測的是什么?有什么意義?


你的理解是正確的,其實FL1, FL2, FL3 是指不同的熒光通道.舉個例子來說吧.我們用FITC/PE雙標記的細胞,在488nm的激光激發(fā)下,這兩種熒光染料分別發(fā)出波長不同的綠色和橙色熒光,然后這發(fā)出的熒光再通過濾光片分開,對應的是不同的波長的濾光片,一般在fl1那的是530nm的濾光片,在FL2那的是575nm的濾光片,這樣就可以把在一起的熒光分開了。


6、用于做Western 或ELISA的一抗可否用于流式細胞術?


看你說明書上是怎么說的了,如果沒有說就不可以做流式,需要另外買了。


7、MFI 和 GFI 的意義?


Geo Mean,叫做幾何均數(shù)(geometricmean),常用于等級資料和對數(shù)正態(tài)分布資料,和常用的算數(shù)均數(shù)(mean)的計算方法不同。%26ldquo; %total或者%gate的結果%26rdquo;代表的是百分率,即細胞占總體細胞或者是門內(nèi)細胞的百分比;用百分比作為統(tǒng)計指標,適用于熒光表達較強的指標。我看到你的流式圖上,檢測樣本的熒光強度不是很強,屬于弱表達的指標,若用百分率統(tǒng)計,就是會失去一部分弱陽性的數(shù)據(jù)。我建議可以用平均熒光強度(也就是mean值)作為統(tǒng)計指標,比較熒光強度的變化。


8、流式技術中的APC,pure 標記是什么意思呢?


熒光物質通常是指那些在受到一個波長激發(fā)后,處于一個能量不穩(wěn)定的狀態(tài),能發(fā)射一個波長比激發(fā)波長長的光的一類物質。當然熒光并不都是受激發(fā)后發(fā)射的,如一些生物可以發(fā)射熒光,如熒火蟲,發(fā)光細菌等,他們發(fā)出的光是通過體內(nèi)的酶促反應而產(chǎn)生的,這個酶通常被稱為熒光素酶.EB是一種熒光物質,它在受到紫外線照射后可以發(fā)出一可見光,常用于DNA、RNA電泳中。


APC


英文全名:allophycocyanin;中文名:別藻青蛋白;最大吸收峰:650nm,最大發(fā)射熒光峰:660nm,適用于雙激光流式儀,可被600-640nm波長的激光激發(fā)。


PerCP


英文全名:peridinin chlorophyll protein,中文名:多甲藻葉綠素蛋白;最大激發(fā)波峰490nm,被488nm的氬離子激光激發(fā)后,發(fā)射光峰值約為677nm,與FITC、PE進行多色熒光染色補償重疊較少,非特異性結合也較少。雖然較易使用,但量子產(chǎn)量不高,多用于檢測表達較高的抗原。


9、怎樣用流式細胞儀來鑒定小鼠BMDC?


檢測小鼠BMDC主要是從形態(tài)學和細胞表面分子兩方面來鑒定我做的時候就做了普通光鏡下形態(tài)、電鏡(掃描和透射),另外檢測了小鼠BMDC表面的共刺激分子如CD86、CD11、CD80。還做了MHC II類分子的檢測,還有MHCI類分子的檢測,這些分子在DC表面都不是特異存在的,在巨噬細胞、淋巴細胞表面也有表達,所以目前并沒有非常特異性的方法檢測你的細胞一定就是DC,但是從形態(tài)和表面分子的檢測結合來看,效果就比較好了.一般在幼稚的DC上述分子表達水平較低,DC成熟過程中,上述分子表達呈上調(diào)趨勢,你可以在不同的培養(yǎng)時間分別檢測。


10、請問流式細胞術單抗直接熒光需要幾種對照?


首先確認你用的直標抗體的熒光染料是什么,再確定該抗體的來源種屬,選擇相應的同型對照。如:你現(xiàn)在想檢測小鼠淋巴細胞表面的CD4抗原,熒光染料為FITC, 抗體來源為大鼠的IgG1亞型, 即Rat anti Mouse CD4-FITC (IgG1),你所需要的同型對照就應該是Rat IgG1-FITC, 一般的抗體說明上都會寫清。


11、6孔板的細胞量能否做流式呀?


對于6孔板而言,每孔的表面積為10 cm2,依細胞種類不同在長滿時達到的數(shù)量從5*10的5次方到5*10的6次方不等。6孔板絕對沒問題的!甚至24孔板也可以正常做。不過用于調(diào)試儀器參數(shù)的正常細胞要多準備一些。


12、血液里的mononuclear cell(除外紅細胞,血小板和破碎的細胞碎片),能不能用細胞大小來gating,只看我關心的細胞?


(1)紅細胞還是小一些,無法100%區(qū)分,但還是可用把大部分紅細胞gate掉。


(2)溶血也很重要,如果你的紅細胞多的話。(我猜不少,如果用ficol的話)??梢杂寐然@溶液,如ACK(Lonzo),(3)CD45是所有白細胞都表達的,可以用來區(qū)分RBCvs. WBC13、細胞膜蛋白變化是用流氏檢測好,還是要做western?


膜蛋白的提取,好像很費功夫,提取的不好,western結果也就不可信。流式需要的抗體很少,流式能夠檢測陽性表達細胞的比例,western能對總的表達定量,各有有缺點。


14、FCM檢測表達結果到底是用百分比還是MFI?


我作出是單峰,原本我覺得用MFI表示較好。但我做的2個蛋白很奇怪,一個表達率高,但MFI值低;另一個表達率低,但MFI值高。我又作了SYBRGREEN 定量PCR,發(fā)現(xiàn)mRNA 的表達基本與百分比相符,而與MFI值不太一致。


個人認為如果有明顯陰性細胞群和陽性細胞群,應計算百分比;無明顯分群,僅熒光強度發(fā)生變化的應該用MFI。如果是整體峰移(或者叫單峰),那么根本不存在MFI之外的任何合理的指標,不管MFI跟其它指標吻合度如何,這就是客觀數(shù)據(jù)、客觀事實。


15、培養(yǎng)細胞的bcl-2及Bax蛋白的檢測?


首先制成單細胞懸液,PBS洗滌后用胞內(nèi)染色試劑盒(很多公司都有,其實就是固定劑加增透/打孔劑)進行處理,再進行抗體孵育標記染色,洗滌后上樣。


16、流式檢測胞內(nèi)抗原時打孔液的配方?


打孔液有很多種,方法也有很多。與你的實驗方法相關。我用過酒精固定或Triton X-100(我做的都是培養(yǎng)的細胞):


(1)70%的酒精固定24小時即可,不再需要再打孔。如在PI染色測細胞周期或凋亡。


(2)Triton X-100是比較強烈的穿孔劑。0.1% Triton X-100/PBS(再加0.1%BSA)是比較溫和一點。濃度可適當提高。作用時間以幾分鐘為宜。這個時間必須要自己試。時間長了細胞易破裂,短了則打孔不夠。如果你要染胞漿,則時間適當短些,如果要染內(nèi)質網(wǎng)或核內(nèi)等,由于要對兩層膜性結構打孔,時間當然會長一些(3)可以試試0.1% saponin(皂素)


17、標本必須在抗體染色后30分內(nèi)檢測嗎?


SOP是這么說的:


(1)Keep samples after staining covered with aluminum foil and at 4 0C(in the refrigerator) until they are run for flow analysis. The samplesshould be analyzed within 48 hours. Fluorescence loses its brightness ifcells are not kept properly: not at 4 0C, or are exposed to light(2)Ifcells are not fixed with paraformaldehyde, keep the samples on ice andrun them immediately after staining isaccomplished因此,如果你沒有用PBS洗的話,可以用paraformaldehyde固定,放置48小時。洗了后應該盡快檢測。如果做好不能及時檢測,我們一般是加入等量的2%的多聚甲醛固定,4度冰箱避光貯存。一般過夜沒有問題,第二天同樣PBS2ml 洗滌細胞一次,上機檢測。


18、如何分選原始紅細胞?


CD71(轉鐵蛋白受體)--幼稚細胞的標記


CD235(GPA)--紅細胞的標記(小鼠有Ter119)


雙陽性細胞即為幼稚紅細胞,但無法區(qū)分原始及中晚幼紅.


19、請問流式檢測膜蛋白表達的變化用多克隆抗體出結果的機會大嗎?


流式的抗體和WB的抗體是不同的(有部分可以通用),多抗一般是大的變性蛋白為抗原制備的,而WB的中被檢測蛋白就是變性狀態(tài),所以很吻合,而流失中一般蛋白還是保持了天然構象,所以產(chǎn)生的多抗可能不太好,而需要用很小特定的決定簇為抗原制備單克隆抗體。


20、在下最近作人外周血流式,作表面及其胞內(nèi)染色,試劑說明書說要先分離外周血單個核細胞再染色,我有時候分的紅細胞比較多,其他的方法試過了,都改進的不好,我擔心紅細胞會有影響,想在分離出PBMC以后如果紅細胞比較多的話,就用紅細胞裂解液裂解一下,但是我有如下問題,希望這樣做過的同志指點一下,感激不禁。


(1)有人這樣在分離PBMC以后再裂解的嗎(我知道一般是在全血染色后再裂解紅細胞)?


(2)這樣會影響流式檢測嗎?


(3)用的裂解液配方是什么(最好是自己用過的)。


(4)用法是什么{我是在如果PBMC分出來以后要是紅細胞比較多的時候使用,這樣要怎樣把分出的PBMC稀釋,加多少裂解液 裂解多長時間,裂解后洗滌幾次等等}。


我曾做骨髓液分離單個核細胞而后做流式,一般來說用Ficoll分過之后即便還有紅細胞殘留,上流式也可通過%26ldquo;設門%26rdquo;根據(jù)細胞形態(tài)大小將紅細胞剔除。若紅細胞殘留太多,則可通過紅細胞裂解液進一步去除之。我用的裂解液配方是:


碳酸氫鉀(KHCO3) 1.0g


氯化氨(NH4CL) 8.3g


EDTA-Na2 0.037g 加雙H2O至1000ml,為工作液。


配好后4度冰箱保存,使用時效果更好。我是在Ficoll分過之后用的,所以一般根據(jù)離心后EP管里細胞團的大小加紅細胞裂解液,通常5ml骨髓液分離單個核細胞后得到的細胞再加500ul裂解液,震蕩混勻置2-5分鐘紅細胞就基本上裂解干凈了。洗滌次數(shù)看白細胞多少而定,因為洗的次數(shù)越多,損失就越多。我一般洗一到兩次就OK了.做了很久沒發(fā)現(xiàn)這樣處理影響結果。有一點,我是在這樣處理后才標記抗體的,樓上的說是標記過才溶紅細胞,所以建議在溶的時候時間不宜過長,洗滌次數(shù)也不宜過多,以免將標記上的單抗洗脫。


21、請問下表中流式細胞儀給出的平均值是什么意思,是怎樣得到的,有些文獻中提到%26ldquo;fluorescence per cell%26quot;,是下面的mean值嗎,還是要用mean值除以第1欄的細胞數(shù)events,才能得到fluorescence per cell ?


mean 值就是每個細胞的平均熒光強度,不用再除細胞數(shù)。這只是個相對值,如果求絕對值,應用已知熒光劑濃度值對應儀器給出的mean值,做標準曲線。以后你得到的mean值,就可以根據(jù)這條標準曲線查出真正的熒光濃度值。


22、流式中檢測細胞表面和細胞內(nèi)蛋白表達水平的抗體有何區(qū)別?


抗體只是針對相應抗原的,至于是針對胞內(nèi)還是胞膜對你檢測來說并無明顯影響,你只需要查清楚到底是針對哪一個部位的抗原的,應該是可以用同一種抗體進行檢測的,在流式操作時只需注意:如果是針對胞內(nèi),則需要加破膜劑,讓抗體能和相應抗原接觸,否則就不需要了。


23、請教各位前輩:只要是熒光抗體久可以用于共聚焦顯微鏡嗎?


一般情況下都是可以的。但有時候強度不夠,需要選擇熒光強度大的染料,比如Alexa系列的。


24、流式細胞儀檢測細胞周期是否需要雞紅細胞作參照?


不用,標準微球做完laser alignment(光路校正)就可以了。盡量把微球的各色CV值控制在1.5以內(nèi)。


25、我現(xiàn)在要用間接法流式細胞術,剛買了熒光二抗,是KPL的fluorescein-labeled affinity purified antibody to mouse IgG+IgM(H+L) produced in goat .說明說上提示要用TBS或是BSA或milk diluent/blocking solution液稀釋。稀釋至1:10~1:100。請問BSA是不是小牛血清,要用多少濃度的。TBS液我沒有,還有可否用注射用水稀釋。


BSA:牛血清白蛋白,濃度可以在一定范圍內(nèi)1%~5%,具體可參考其他抗體說明書。


TBS:Tris buffer saline。就是Tris的鹽溶液,很常規(guī)的溶液,配方:20mM Tris-HCl(ph8.0),150mM NaCl。


你說的注射用水應該就是生理鹽水吧,這對抗體來說是不利的,雖然在基礎條件很差的情況下會用這個溶液,但是還不如PBS溶液。既然是做流式,按照正規(guī)程序操作抗體,得到的結果也最能反映真實情況。


26、流式細胞檢測中怎樣把對照和樣本的檢測結果放在一張圖中?


分析獲取數(shù)據(jù)是分開進行的,不可以混在一起上樣。首先通過陰性對照調(diào)節(jié)基本電壓,固定條件后進行樣品檢測,分別保存結果。利用流式軟件的multigraph中的overlap可以將陰性對照和樣品結果相應圖進行疊加,這只是獲取數(shù)據(jù)后對結果的組合和加工。



來源:中華檢驗醫(yī)學網(wǎng) (原文網(wǎng)址見本文“閱讀原文”)


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