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包涵體復性常見問題分析 1. 對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇? 尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑，易經(jīng)透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用，所需濃度尿素8-10M，鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱，溶解度為70-90%，尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽，對重組蛋白質的氨基進行共價修飾，但用尿素溶解具有不電離，呈中性，成本低，蛋白質復性后除去不會造成大量蛋白質沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優(yōu)點，故目前已被廣泛采用。 鹽酸胍溶解能力達95%以上，且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產(chǎn)生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質沉淀和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。 2. 怎樣洗滌包涵體？ 通常的洗滌方法一般是洗不干凈的，可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分，過濾除去未溶解的物質，注意留樣跑電泳，然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳，如此類推可以一直稀釋到合適的濃度，可以找到一個合適去除雜質的辦法，其實這就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脫效果好。 3. 8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存? 在4度放置半個月，都沒什么問題 。在室溫放置超過48小時，可能會對目的蛋白有影響，因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸?；?，所以早些處理BI溶液比較好。 4. 包涵體復性有什么原則？ 低濃度，平緩梯度，低溫。 5. 復性時的蛋白濃度是？ 一般使用濃度為0.1-1mg/ml，太高的濃度容易形成聚體沉淀，太低的濃度不經(jīng)濟，而且很多蛋白在低濃度時不穩(wěn)定，很容易變性。 6. 復性中蛋白析出是怎么回事？該怎么處理？ 出現(xiàn)蛋白析出，肯定是條件變化太劇烈了。復性應該采取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法，例如根據(jù)包涵體的溶液成分，每隔1個PH或濃度值配置一種溶液，逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低，條件溫和，使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。 若加變性劑尿素可加到2M，鹽酸胍可加到1-1.5M； 另外可將甘油濃度增加，范圍可在≤30%，且在復性樣品中也可加適量甘油。 包涵體復性效率和檢測 復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質復性的過程控制相關外，還很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發(fā)現(xiàn)能夠對其進行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾。一般說來，蛋白質的復性效率在20%左右。影響復性效率的因素有蛋白質的復性濃度，變性劑的起始濃度和去除速度、溫度、pH、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。根據(jù)具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。其效果檢測方法如下： 1. 凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態(tài)的蛋白質，或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。 2. 光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態(tài)下的光譜學特征進行復性情況的檢測，但一般只用于復性研究中的過程檢測。 3. 色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于兩種狀態(tài)的蛋白色譜行為不同。 4. 生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。 5. 黏度和濁度測定：復性后的蛋白溶解度增加，變性狀態(tài)時由于疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉淀析出。 6. 免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態(tài)。 包涵體復性的方法 一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點：活性蛋白質的回收率高；正確復性的產(chǎn)物易于與錯誤折疊蛋白質分離；折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產(chǎn)品；折疊復性方法易于放大；復性過程耗時較少。 1. 透析、稀釋和超濾復性法： 這三種方法是最傳統(tǒng)也是應用最普遍的蛋白質折疊復性方法，復性活性回收率低，而且難于與雜蛋白分離。透析法耗時長，易形成無活性蛋白質聚集體；超濾法在膜上聚集變性，易造成膜污染；稀釋法處理量太大，不利于工業(yè)放大。 2. 凝膠過濾層析復性 凝膠過濾層析復性又稱體積排阻復性(SEC)，是一種廣泛應用的層析技術。與常用的稀釋復性法相比，凝膠過濾層析復性能在高的起始蛋白濃度下對蛋白進行復性，活性回收率較高，同時又能使目標蛋白得到一定程度的純化。 凝膠過濾復性時，除了蛋白質在膠粒中的傳質和擴散外，蛋白質與介質之間并不發(fā)生其它任何作用。復性過程始終發(fā)生在溶液中。蛋白質在伸展狀態(tài)中，每個蛋白質分子的伸展狀態(tài)都會有差別，而不同伸展狀態(tài)的蛋白質分子在凝膠顆粒內部擴散所受到的限制也不相同，有的會擴散入顆粒內部深一些，有的會淺一些，這使不同伸展狀態(tài)的蛋白質分子達到一定程度的分離，這樣蛋白質分子問相互作用的機會就大大減少，從而起到一定抑制凝集的作用；即使發(fā)生了部分凝集，凝集的蛋白質會附著在膠粒上，而不隨著溶液向下運動，這樣后面的變性劑可以趕上凝集的蛋白質，使其重新溶解并變性；并且在凝膠過濾中脲等變性劑脫除得相對較慢，這對有些蛋白質的復性是有利的。 在普通凝膠過濾中，變性劑和還原劑的脫除雖較稀釋復性慢，但變性蛋白質仍會經(jīng)歷變性劑濃度突然變化的過程。脲梯度復性是樣品上柱前用復性緩沖液平衡柱子，接著使變性劑濃度遞減(如從6M 鹽酸胍或8M尿素下降到復性緩沖液中預先確定的變性劑的濃度)。此法為蛋白質復性提供了一個較溫和的環(huán)境，實現(xiàn)了線性去除變性劑，對高濃度變性蛋白質的復性效果十分顯著。對初始濃度為17mg／ml的還原變性溶菌酶，在40min內可以得到高達9O%的活性回收率。此外在脲梯度SEC的基礎上發(fā)展了pH和脲濃度雙梯度SEC法用于蛋白復性，效果很好。 在SEC復性的基礎上設計的連續(xù)基質輔助蛋白復性系統(tǒng)能使變性蛋白定量地轉換成復性的天然態(tài)蛋白。此復性方法能夠將復性過程中產(chǎn)生的蛋白聚集體再次復性，使蛋白最大程度地得到回收。伴侶溶劑塞(Chaperon solvent plug)SEC復性法在一定程度上解決了變性蛋白進入柱頂端之前發(fā)生沉淀這一問題。此外，抗體、小分子添加劑如L一精氨酸和環(huán)糊精等共價結合到SEC固定相上也可能會提高某些蛋白的復性效率，同時又能使這些物質得以重復利用，降低生產(chǎn)成本。 3. 高蛋白濃度下的復性方法： 一個成功的復性過程在于能夠在高蛋白濃度下仍能得到較高的復性率。一個方法是把變性蛋白緩慢連續(xù)或不連續(xù)地加入到復性液中。在兩次蛋白加入之間，應有足夠的時間間隔使蛋白質折疊通過了易聚集的中間體階段。這是由于完全折疊的蛋白通常不會與正在折疊的蛋白一起聚集。第二種方法是用溫度跳躍策略。變性蛋白在低溫下復性折疊以減少聚集，直到易聚集的中間體大都轉化為不易聚集的后期中間體后，溫度快速升高來促進后期中間體快速折疊為蛋白的天然構象。第三種方法是復性在中等的變性劑濃度下進行，變性劑濃度應高到足以有效防止聚集，同時又必須低到能夠引發(fā)正確復性。 4. 添加促進劑的復性方法： 包涵體蛋白質折疊復性促進劑的促進作用可以分為：穩(wěn)定正確折疊蛋白質的天然結構、改變錯誤折疊蛋白質的穩(wěn)定性、增加折疊復性中間體的溶解性、增加非折疊蛋白質的溶解性。通常使用的添加劑有： a) 共溶劑：如PEG6000~20000，通過與中間體特異的形成非聚集的復合物，可以阻止蛋白質分子間的相互碰撞機會，減少蛋白質的聚集； b) 去污劑及表面活性劑：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜堿等對蛋白質復性有促進作用，但它們能與蛋白質結合，很難去除； c) 氧化-還原劑：對于含有二硫鍵的蛋白，復性過程中應加入氧化還原體系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化還原系統(tǒng)通過促進不正確形成的二硫鍵快速交換反應，提高了正確配對的二硫鍵的產(chǎn)率； d) 小分子的添加劑：如鹽酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺類等，都可阻止蛋白聚集，它們的作用可能為：穩(wěn)定蛋白的活性狀態(tài)、降低非正確折疊的穩(wěn)定性、增加折疊中間體的穩(wěn)定性、增加解折疊狀態(tài)的穩(wěn)定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正確折疊的蛋白質結構以及不正確連接的二硫鍵變得不穩(wěn)定，使折疊向正確方向進行，可大幅度地提高包涵體蛋白質的折疊效率。 e) 添加分子伴侶和折疊酶：分子伴侶是指能夠結合和穩(wěn)定另外一種蛋白質的不穩(wěn)定構象，并能通過有控制的結合和釋放，促進新生多肽鏈的折疊、多聚體的裝配或降解及細胞器蛋白的跨膜運輸?shù)囊活惖鞍踪|。折疊酶有二硫鍵異構酶、脯氨酸異構酶等。分子伴侶和折疊酶都能在體外調節(jié)蛋白質的正確折疊，提高蛋白質的合成效率。但這類蛋白在折疊復性后要除去，而且十分昂貴，因此采用可回收利用的方法如固定化法為好。 f) 人工伴侶：為模仿分子伴侶而發(fā)展的一種方法：首先，變性蛋白被復性液中的去污劑捕獲，形成蛋白-去污劑復合體，復合體的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入環(huán)糊精從復合體中去除去污劑，使得蛋白質正確折疊。 g) 單克隆抗體：待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協(xié)助復性，但只限于此蛋白才能獲得明顯的助折疊作用。 h) 其它：多聚離子化合物如肝素可以促進蛋白質的復性，具有穩(wěn)定天然蛋白質的作用；甘油可以增加黏度，減少分子碰撞的機會，減少錯配以提高復性效率；適量的鹽濃度可以降低某些帶電基團間的斥力，有利于蛋白質的折疊；輔助因子、短鏈醇、高滲物等能有效的降低聚集體的形成，對蛋白有穩(wěn)定的作用。 5. 液相色譜（LC）復性法： 液相色譜是一種最有效的純化蛋白質的方法，已成為基因重組蛋白質純化的必不可少的手段，現(xiàn)有報道，疏水相互作用色譜（HIC）、離子交換色譜（IEC）、凝膠排阻色譜（SEC）、親和色譜（AFC）已成功的對變性蛋白進行了復性。與傳統(tǒng)的稀釋法和透析法相比，液相色譜復性的優(yōu)點是： a) 在進樣后可很快的除去變性劑； b) 由于色譜固定相對變性蛋白質的吸附可明顯的減少、甚至完全消除變性蛋白質分子在脫離變性劑環(huán)境后的分子聚集，從而避免了沉淀的產(chǎn)生，提高蛋白質復性的質量和活性回收率； 包涵體形成原因及減少策略 形成原因 1. 表達量過高，研究發(fā)現(xiàn)在低表達時很少形成包涵體，表達量越高越容易形成包涵體。原因可能是合成速度太快，以至于沒有足夠的時間進行折疊，二硫鍵不能正確配對，過多的蛋白間的非特異性結合，蛋白質無法達到足夠的溶解度等。 2. 重組蛋白的氨基酸組成，一般說來含硫氨基酸越多越容易形成包涵體。 3. 重組蛋白所處的環(huán)境：發(fā)酵溫度高或胞內pH接近蛋白的等電點時容易形成包涵體。 4. 重組蛋白是大腸桿菌(Escherichia coli)的異源蛋白，由于缺少真核生物中翻譯后修飾所需酶類，致使中間體大量積累，容易形成包涵體沉淀。 5. 有報道認為，豐富的培養(yǎng)基有利于活性蛋白質的表達，當培養(yǎng)條件不佳時，容易形成包涵體。 減少包涵體形成的策略 1. 降低重組菌的生長溫度，降低培養(yǎng)溫度是減少包涵體形成的最常用的方法，較低的生長溫度降低了無活性聚集體形成的速率和疏水相互作用，從而可減少包涵體的形成。 2. 添加可促進重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑，培養(yǎng)E.coli時添加高濃度的多醇 類、蔗糖或非代謝糖可以阻止分泌到周質的蛋白質聚集反應，在最適濃度范圍內添加這些添加劑不會影響細胞的生長、蛋白質的合成或運輸，其它促重組蛋白質可溶性表達的生長添加劑還有乙醇（誘導熱休克蛋白的表達）、低分子量的巰基或二硫化合物（影響細胞周質的還原態(tài)，從而影響二硫鍵的形成）和NaCl。 3. 供給豐富的培養(yǎng)基，創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，如供氧、pH等。 包涵體復性原理 包涵體是外源基因在原核細胞中表達時，尤其在大腸桿菌(Escherichia coli)中高效表達時，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，在顯微鏡下觀察時為高折射區(qū)，與胞質中其他成分有明顯區(qū)別。包涵體形成是比較復雜的，與胞質內蛋白質生成速率有關，新生成的多肽濃度較高，無充足的時間進行折疊，從而形成非結晶、無定形的蛋白質的聚集體；此外，包涵體的形成還被認為與宿主菌的培養(yǎng)條件，如培養(yǎng)基成分、溫度、pH值、離子強度等因素有關。細胞中的生物學活性蛋白質常以可融性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。包涵體內的蛋白是非折疊狀態(tài)的聚集體，不具有生物學活性，因此要獲得具有生物學活性的蛋白質必須將包涵體溶解，釋放出其中的蛋白質，并進行蛋白質的復性。 |
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