本文總結(jié)了畢赤酵母表達常用的一些載體 以及14種畢赤酵母表達所用培養(yǎng)基，即：LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基、LLB(Low Salt LB)培養(yǎng)基、 YPD (又稱YEPD)、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基、最小甘油培養(yǎng)基(MGY)、葡萄糖再生培養(yǎng)基（RD)等。 一、畢赤酵母表達常用載體 ： 典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子(5'AOX1和3'AOX1)，它們被多克隆位點(MCS)分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因(HIS4)選擇標記及3'AOX1區(qū)。當整合型載體轉(zhuǎn)化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組 ，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號序列。而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α交配因子(α-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞內(nèi)表達載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 (AOX1)，KM71，SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位點彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達菌株的獲得方式： 與自主復(fù)制的質(zhì)粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入;而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。表達蛋白純化方法： 酵母系統(tǒng)表達的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫和的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。 二.畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制和用途 2.1 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl l% PH 7.0 制作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４?。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB(Low Salt LB)培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.5% PH 7.0 制作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃條件下保存1～2周. 2.3 YPD (又稱YEPD) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基) Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存,是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂YPD平板在4℃可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4℃條件下保存1～2周。 2.4 BMGY培養(yǎng)基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸鉀緩沖液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% Glycerol 1% 畢赤酵母誘導(dǎo)表達前培養(yǎng)基，YNB和Biotin過濾除菌。培養(yǎng)24小時后，一般靜置過夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養(yǎng)基，改換BMMY培養(yǎng)基，進入誘導(dǎo)表達階段。 2.5 BMMY培養(yǎng)基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸鉀緩沖液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% methanol 3% 畢赤酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基，YNB和Biotion過濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時每24小時之后加入3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時。 2.6 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol 1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4℃條件下，有效期1～2周。 2.7 MGY Minimal Glycerol Medium (最小甘油培養(yǎng)基) (34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4℃保存，保存期為2個月。 2.8 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸) 在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4℃保存，保存期為2個月。 2.9 RD Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培養(yǎng)基) (含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸) 1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌; 2. 冷卻后于45℃水浴; 3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。 2.10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸) 在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4℃保存。 2.11 RD及RDH平板的制備 1. 將186g的山梨醇和15~20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60℃水浴; 2. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻; 3. 迅速制備平板。4℃可保存數(shù)月。 2.12 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備(常用于酵母菌的包被) 1.將186g的山梨醇和7.5~10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60℃水浴; 2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻; 3.將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。 2.13 MD與MDH Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +( 0.004 %組氨酸) (含有：1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖) 1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可; 2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可; 3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。 2.14 SOC培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.05% Glucose (1mol / L) 2% 121℃高壓滅菌 20min，冷卻后，4℃保存。 母液的配置注： 10*YNB (含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基) 4℃保存。34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無硫酸銨)+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。 500*B (0.02%生物素 Biotin) 4℃保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。 100*H (0.4%Histidine 組氨酸) 4℃保存 保存期為1年。400mg的L-組氨酸溶于100ml水中，(加熱至50℃以促進溶解)，過濾除菌。 10*D (20%Dextrose 葡萄糖) 保存期為1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。 10*M (5%Methanol 甲醇) 保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。 10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。 100*AA (0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸) 4℃保存 保存期為1年。分別將500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。 1M 磷酸鉀溶液(potassium phosphate buffer，pH6.0)，將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻，其pH為6.0，如需調(diào)節(jié)pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH。 培養(yǎng)基母液配制好了，均要在4℃保存，如果出現(xiàn)沉淀、白色絮狀物質(zhì)等，有可能是溶液配制不恰當產(chǎn)生了沉淀（可能是水質(zhì)問題等）、母液被菌類污染等，一定要重新配置溶液。
本文總結(jié)了畢赤酵母表達常用的一些載體 以及14種畢赤酵母表達所用培養(yǎng)基，即：LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基、LLB(Low Salt LB)培養(yǎng)基、 YPD (又稱YEPD)、BMGY培養(yǎng)基、BMMY培養(yǎng)基、YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基、最小甘油培養(yǎng)基(MGY)、葡萄糖再生培養(yǎng)基（RD)等。 一、畢赤酵母表達常用載體 ： 典型的巴斯德畢赤酵母表達載體載體包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的啟動子和轉(zhuǎn)錄終止子(5'AOX1和3'AOX1)，它們被多克隆位點(MCS)分開，外源基因可以在此插入。此載體還包含組氨醇脫氫酶基因(HIS4)選擇標記及3'AOX1區(qū)。當整合型載體轉(zhuǎn)化受體時，它的5'AOX1和3'AOX1能與染色體上的同源基因重組 ，從而使整個載體連同外源基因插入到受體染色體上，外源基因在5'AOX1啟動子控制下表達。畢赤酵母本身不分泌內(nèi)源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引導(dǎo)分泌的信號序列。而由89個氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號—α交配因子(α-factor)引導(dǎo)序列已經(jīng)成功地引導(dǎo)了幾種外源蛋白的分泌。分泌表達載體主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZα A，pYAM75P等。胞內(nèi)表達載體主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ， pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115 (AOX1)，KM71，SMD1168。畢赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71兩種，都具有HIS4營養(yǎng)缺陷標記。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut+，即甲醇利用正常型;而KM71菌株的AOX1位點彼ARG4基因插入，表型為Muts，即甲醇利用緩慢型，兩種菌株都適用于一般的酵母轉(zhuǎn)化方法。多拷貝表達菌株的獲得方式： 與自主復(fù)制的質(zhì)粒型表達載體不同，整合型表達載體的拷貝數(shù)可以有很大的變化。含多拷貝外源基因的表達菌株合成蛋白的量也較多。體內(nèi)整合可通過高遺傳霉素抗性，篩選可能的多拷貝插入;而體外整合可通過連接產(chǎn)生外源基因的串聯(lián)插入。多拷貝表達菌株的獲得方式有兩種：一種是利用SDS-PAGE電泳、免疫雜交或菌落點雜交方法在大量的轉(zhuǎn)化子中進行自然篩選。得到產(chǎn)量高的表達菌株。另一種在轉(zhuǎn)化前將多個表達盒拷貝插入到單個載體中，而后再通過交換整合到受體染色體上。表達蛋白純化方法： 酵母系統(tǒng)表達的蛋白一般都具有活性，所以都采用較溫和的純化方式來純化目的蛋白，分泌型表達的蛋白有利于純化，可用硫酸銨沉淀，然后用離子交換，凝膠過濾層析，疏水層析等方法進一步純化。具體的方法和操作應(yīng)按所處理的目的蛋白的性質(zhì)選擇。 二.畢赤酵母表達的培養(yǎng)基配制和用途 2.1 LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl l% PH 7.0 制作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４妗Ｓ糜谂囵B(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時可加入Zeocin 25ug / ml。 2.2 LLB(Low Salt LB)培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.5% PH 7.0 制作平板時加入 2%瓊脂 粉。121℃高壓滅菌 20min?？捎谑覝乇４鏀?shù)月。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌TOP10F’時，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃條件下保存1～2周. 2.3 YPD (又稱YEPD) Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基) Trypton 2% dextrose (glucose) 2% +agar 2% +Zeocin 100 μg/ml 液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存,是畢赤酵母的最基本培養(yǎng)基，瓊脂YPD平板在4℃可保存幾個月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4℃條件下保存1～2周。 2.4 BMGY培養(yǎng)基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸鉀緩沖液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% Glycerol 1% 畢赤酵母誘導(dǎo)表達前培養(yǎng)基，YNB和Biotin過濾除菌。培養(yǎng)24小時后，一般靜置過夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培養(yǎng)基，改換BMMY培養(yǎng)基，進入誘導(dǎo)表達階段。 2.5 BMMY培養(yǎng)基 Yeast extract 1% Peptone 2% 磷酸鉀緩沖液(pH6.0)100mmol/L YNB 1.34% Biotin (4×10 -5 )% methanol 3% 畢赤酵母誘導(dǎo)表達培養(yǎng)基，YNB和Biotion過濾除菌。搖瓶培養(yǎng)時每24小時之后加入3%的甲醇誘導(dǎo)，一般誘導(dǎo)72小時。 2.6 YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium)： yeast extract 1% peptone 2% dextrose (glucose) 2% sorbitol 1 M +agar 2% + Zeocin 100 μg/ml 不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4℃條件下，有效期1～2周。 2.7 MGY Minimal Glycerol Medium (最小甘油培養(yǎng)基) (34%YNB;1%甘油;4*10-5%生物素)。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4℃保存，保存期為2個月。 2.8 MGYH Minimal Glycerol Medium + Histidine (最小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸) 在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4℃保存，保存期為2個月。 2.9 RD Regeneration Dextrose Medium (葡萄糖再生培養(yǎng)基) (含有：1mol/L的山梨醇;2%葡萄糖;1.34%YNB;4*10-5%生物素;0.005%氨基酸) 1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌; 2. 冷卻后于45℃水浴; 3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。 2.10 RDH Regeneration Dextrose Medium + Histidine (葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸) 在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4℃保存。 2.11 RD及RDH平板的制備 1. 將186g的山梨醇和15~20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60℃水浴; 2. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻; 3. 迅速制備平板。4℃可保存數(shù)月。 2.12 RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備(常用于酵母菌的包被) 1.將186g的山梨醇和7.5~10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌;冷卻后于60℃水浴; 2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB;2ml的500*B;10ml的100*AA等母液、(10ml的100*H母液)和88(78)ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻; 3.將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。 2.13 MD與MDH Minimal Dextrose Medium +(Histidine) 最小葡萄糖培養(yǎng)基 +( 0.004 %組氨酸) (含有：1.34%YNB;;4*10-5% 生物素;2%葡萄糖) 1. 100ml的10*YNB;2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可; 2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可; 3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。 2.14 SOC培養(yǎng)基： Trypton l% Yeast Extract 0.5% NaCl 0.05% Glucose (1mol / L) 2% 121℃高壓滅菌 20min，冷卻后，4℃保存。 母液的配置注： 10*YNB (含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基) 4℃保存。34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基(無硫酸銨)+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。 500*B (0.02%生物素 Biotin) 4℃保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。 100*H (0.4%Histidine 組氨酸) 4℃保存 保存期為1年。400mg的L-組氨酸溶于100ml水中，(加熱至50℃以促進溶解)，過濾除菌。 10*D (20%Dextrose 葡萄糖) 保存期為1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。 10*M (5%Methanol 甲醇) 保存期為2個月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。 10*GY (10%Glycerol 甘油)保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。 100*AA (0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸) 4℃保存 保存期為1年。分別將500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。 1M 磷酸鉀溶液(potassium phosphate buffer，pH6.0)，將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻，其pH為6.0，如需調(diào)節(jié)pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH。 培養(yǎng)基母液配制好了，均要在4℃保存，如果出現(xiàn)沉淀、白色絮狀物質(zhì)等，有可能是溶液配制不恰當產(chǎn)生了沉淀（可能是水質(zhì)問題等）、母液被菌類污染等，一定要重新配置溶液。 |
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