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核苷類化合物作為中藥材中的基礎(chǔ)類物質(zhì)之一，可以直接或間接作為藥物使用且在抗病毒、抗腫瘤方面展示了不可取代的獨(dú)特作用，備受研究者重視。核苷類化合物是生物細(xì)胞維持生命活動的基本組成單元，其參與了DNA代謝過程且具有多種生物活性，在生物制藥及其臨床應(yīng)用中都有著廣泛的用途?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，核苷類物質(zhì)能具有改善心腦血液循環(huán)、防止心率失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)酸環(huán)化酶活性等功效，一些核苷類化合物對支氣管炎、抗心率不齊、各種原因引起的白細(xì)胞減少癥、止咳化痰等有很好的療效。 胞苷，分子式：C9H13N3O5，分子量243.2，溶解性：溶于水、酸和堿，微溶于乙醇，不溶于有機(jī)溶劑，其結(jié)構(gòu)式如圖2-1（a）。 次黃嘌呤，分子式：C5H4N4O，分子量：136.1，溶解性：水中溶解度為0.078/100m1（19℃），1.4g/100m1（100℃）。溶于稀酸和堿，其結(jié)構(gòu)式如圖2-1（b）。 鳥嘌呤，分子式：C5H5N5O，分子量：151.13，溶解性：易溶于氨水、氫氧化鈉和稀酸溶液，微溶于乙醇和乙醚幾乎不溶于水，其結(jié)構(gòu)式如圖2-1（c）。 腺嘌呤，分子式：C5H5N5，分子量：135.22，溶解性：室溫下微溶于水，易溶于堿，其結(jié)構(gòu)式如圖2-1（d）。  本文采用新型提取技術(shù)超聲-微波協(xié)同萃取法提取金線蓮中的胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤4種核苷類物質(zhì)，高效液相色譜法-電噴霧電離/離子阱質(zhì)譜法（high performance liquid chromatogrpahy-electrospray ionization/ion trap mass spectrometry，HPLC-ESI/MS）對提取物中核苷類物質(zhì)進(jìn)行測定和鑒別。 1、主要儀器與試藥 1.1 主要儀器 1200型HPLC-MSD高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司） Agilent TC-Cl8（ODS）色譜柱（5μm，4.6*250mm，美國Agilent公司） LC-20Atvp高效液相色譜儀（口本島津） CW-2000超聲-微波協(xié)同萃取儀（新拓微波溶樣測試技術(shù)有限公司） DJ-l0A型傾倒式粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司） RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠） LXJ-IIB型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠） 1.2 試劑 胞苷（阿拉丁試劑公司，含量99%；） 次黃嘌呤（阿拉丁試劑公司，含量99%；） 鳥嘌呤（阿拉丁試劑公司，含量98%；） 腺嘌呤（阿拉丁試劑公司，含量99%；） 胸腺嘧啶（阿拉丁試劑公司，含量98%；） 金線蓮全草（購自福建省同春藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地為廣西，經(jīng)福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)教研室張永紅教授鑒定） 三乙胺（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 乙酸按（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司） 2、實(shí)驗(yàn)方法 2.1 色譜分離條件 色譜柱：Agilent TC-C18柱（5μm，4.6*250mm），流動相：甲醇-0.05%三乙胺/0.02mo1/L乙酸按緩沖鹽水溶液（5：95），流速：0.6mL/min，檢測波長：260nm，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20μL 。 2.2 質(zhì)譜條件 ESI離子源，檢測模式正離子（+）；掃描范圍：m/z 100-800；干燥氣流速（N2）：7L/min；電暈電流：4000nA；干燥氣溫度：350℃；毛細(xì)管電壓：3500V；噴霧器壓力：40Psi。 2.3 內(nèi)標(biāo)溶液制備 稱取胸腺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品0.1000g，置于10mL容量瓶，用水定容，得到1.0mg/mL的胸腺嘧啶內(nèi)標(biāo)液。稀釋得到以下一系列濃度1.0μg/mL，2.0μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL，40.0μg/mL，60.0μg/mL，80.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 2.4 對照品溶液制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的鳥嘌呤、腺嘌呤對照品各0.1000g分別置于10mL容量瓶中，加入0.1氫氧化鈉溶液2mL溶解，用水稀釋至刻度，配制成1mg/mL的對照品溶液作為母液。精密稱取胞苷、次黃嘌呤對照品各0.1000g，分別加水定容至10mL容量瓶，配制成1mg/mL的對照品溶液作為母液，分別精密吸取各個(gè)對照品的母液0.1mL，0.2mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，6.0mL，8.0mL分別置100mL容量瓶中，得1.0μg/mL，2.0μg/mL，5.0μg/mL，10.0μg/mL，20.0μg/mL，40.0μg/mL，60.0μg/mL，80.0μg/mL系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中各加入一定量內(nèi)標(biāo)溶液使內(nèi)標(biāo)物的濃度均為10.0μg/mL，吸取上述混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，進(jìn)樣20μL，按上述色譜條件測定。 2.5 藥材供試品的制備 稱金線蓮粉末（過80目篩），約1.0g，精密稱定，置于超聲一微波協(xié)同萃取儀容器中，加入20倍量的0.1氫氧化鈉溶液，于超聲一微波協(xié)同萃取儀50℃恒溫條件下提取45min，萃取2次，合并兩次萃取液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得浸膏，用少量水溶解定容于25mL容量瓶中，過0.45μm微孔濾膜，加入1.0mg/mL的胸腺嘧啶內(nèi)標(biāo)液適量，使樣品中內(nèi)標(biāo)物濃度為10.0μg/mL作為待用的供試品溶液。 3、結(jié)果與討論 3.1 線性范圍的考察 取8個(gè)濃度（1.0-80.0μg/mL）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液20μL，按照上述色譜條件重復(fù)測定3次，以各對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，各對照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程見表2-1， 結(jié)果表明，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤在1.0-80.0μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2-2。 3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液和金線蓮提取物的HPLC-UV分析 圖2-3，圖2-4和圖2-5分別顯示了在上述的色譜條件下，采用UV檢測方法獲得的混合對照品加內(nèi)標(biāo)物、金線蓮萃取產(chǎn)物加內(nèi)標(biāo)和金線蓮萃取產(chǎn)物未加內(nèi)標(biāo)的HPLC色譜圖。標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖2-3顯示，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶（內(nèi)標(biāo)物）、腺嘌呤的保留時(shí)間分別是8.16min，8.99min，9.90min，13.20min，19.02min，各對照品的濃度均為10.0μg/mL。根據(jù)保留時(shí)間，樣品的色譜圖2-4的1，2，3和5號色譜峰分別初步鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤，4號色譜峰為內(nèi)標(biāo)物胸腺嘧啶。 3.3 LC-ESI（+）/MS鑒定金線蓮中核苷類物質(zhì) 為進(jìn)一步確認(rèn)這些色譜峰的歸屬，必須考察對應(yīng)化合物在相同條件下的結(jié)構(gòu)信息。在設(shè)定的HPLC-ESI（+）/MS條件下，分別對胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤的對照品和超聲一微波協(xié)同萃取樣品進(jìn)樣，經(jīng)色譜分離后對保留時(shí)間分別是8.16min，8.99min，9.90min，19.02min色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到各離子峰的精確質(zhì)量數(shù)，圖2-6（al），圖2-7（a2），圖2-8（a3）和圖2-9（a4）分別顯示了胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤的對照品在源內(nèi)碰撞輔助解離模式下ESI（+）的質(zhì)譜圖。圖2-6（b1），圖2-7（b2），圖2-8（b3）和圖2-9（b4）是金線超聲一微波協(xié)同提取物色譜圖對應(yīng)1，2，3，5號色譜峰的質(zhì)譜圖。胞苷生成的準(zhǔn)分子[M+H] + 離子峰m/z244.3和特征碎片峰m/z112.0，特征碎片峰m/z112.0是[M+H] + 其脫去一個(gè)D一脫氧核糖形成的碎片峰[M+H-rlb] +，見圖2-6（al，b1）；次黃嘌呤生成的準(zhǔn)分子[M+H] +離子峰m/z137.1和特征碎片峰m/z119.0，特征碎片峰m/z119.0是[M+H] +脫去H2O形成的碎片峰[M+H-H2O]+，同時(shí)它的另外一個(gè)主要裂解途徑是失去HCN得到碎片峰m/z110即碎片峰[M+H-HCN]+，見圖2-7（a2，b2）；鳥嘌呤生成準(zhǔn)分子[M+H]+離子峰m/z152.2和斷裂生成的碎片峰m/z135.1和m/z109.9，特征碎片峰m/z135.1是[M+H]+脫去H2O形成的碎片峰[M+H-H2O]+，碎片峰m/z109.9是[M+H]+脫去NHZCN形成的碎片峰[M+H-NH2CN]+，見圖2-8（a3，b3）；腺嘌呤生成準(zhǔn)分子[M+H]+離子峰m/z136.2和特征碎片峰m/z119.2，特征碎片峰m/z119.2是[M+H]+脫去NHS形成的碎片峰[M+H-NH3]+，見圖2-9（a4，b4）。 基于m/z值、紫外色譜保留時(shí)間、對照品和文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較日分析，保留時(shí)間分別為8.16min，8.99min，9.90min和19.02min處的色譜峰對應(yīng)的物質(zhì)分別鑒定為胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤。 3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 將同一濃度的混合對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤腺嘌呤4個(gè)對照品測得峰面積的RSD分別為0.48%，1.52%，0.76%，0.32%。證明精密度良好。 3.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品溶液分別于0，2，4，6，8，12，24h進(jìn)樣，胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤4個(gè)對照品測得峰面積的RSD分別為1.92%，3.41%，2.25%，1.21%。說明樣品溶液在24小時(shí)內(nèi)基本穩(wěn)定。 3.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批金線蓮粉末6份，分別依樣品溶液的制備方法操作，測得胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤4個(gè)對照品測得峰面積的RSD分別為0.78%，2.72%，1.24%，3.12%。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。 3.7 加樣回收實(shí)驗(yàn) 取金線蓮藥材（過80目篩）6份，各約1.0g精密稱定，加入適量的對照品溶液，按供試品溶液制備方法制成加樣回收樣品液，測定胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤平均回收率分別為95.42%，93.18%，92.47%，93.09%，90.58%；RSD分別為2.34%，1.57%，2.05%，2.17%。 3.8 樣品含量測定 以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算樣品中胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤的含量，測定結(jié)果見表2-2。 4、結(jié)論 （1）詳細(xì)闡明了4種核苷類物質(zhì)在離子阱質(zhì)譜中的質(zhì)譜裂解規(guī)律，并建立了HPLC-APCI-MS對金線蓮中4種核苷類化合物分離定性和定量的方法。為金線蓮的藥理活性研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，從分子水平上解決金線蓮藥效學(xué)的問題。 （2）首次應(yīng)用超聲一微波協(xié)同萃取法提取金線蓮中的胞苷、次黃嘌呤、鳥嘌呤、腺嘌呤4種核苷類物質(zhì)，并在該種植物中首次發(fā)現(xiàn)含有這4種核苷類物質(zhì)。為進(jìn)一步發(fā)展新型高效、高選擇性的中藥分離分析模式以及金線蓮的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。
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