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曲向陽1 ,2 汪鳴1 姚火春1* （1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京，210095； 2. 美國(guó)禮來亞洲公司上海代表處，上海，200021；） 中圖分類號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)： 傳染性胃腸炎(Transmissible Gastro-Enteritis,TGE)、豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）、輪狀病毒感染(Rotavirus Infection)是導(dǎo)致冬春季節(jié)新生仔豬病毒性腹瀉的三大重要病因。從2010年10月份開始，新生仔豬病毒性腹瀉在東南亞多個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家呈現(xiàn)高發(fā)病率、高死亡率的流行態(tài)勢(shì)，波及我國(guó)南方10余個(gè)養(yǎng)豬大省，死亡仔豬超過100萬頭[1]，給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前對(duì)其病因的研究與探索還在持續(xù)，尚未達(dá)成統(tǒng)一看法，如：“博卡病毒說”，“底色病說”等等。自2011年12月中旬起，仔豬的病毒性腹瀉在華東地區(qū)多家規(guī)?；i場(chǎng)再次爆發(fā)，現(xiàn)將其中兩例的診斷與防控建議匯報(bào)如下，以期與同行探討。 1 發(fā)病狀況 自2011年12月中下旬起，華東地區(qū)兩家規(guī)模化豬場(chǎng)（豬場(chǎng)A與豬場(chǎng)B）先后發(fā)生大規(guī)模的腹瀉。發(fā)病急，傳播快，7天內(nèi)各生產(chǎn)階段的豬均出現(xiàn)腹瀉。不同年齡階段豬只的發(fā)病順序也基本一致，均是育肥豬先出現(xiàn)水樣腹瀉，而后傳染至保育豬，再到妊娠母豬，最后是產(chǎn)房母豬與哺乳仔豬。兩豬場(chǎng)均曾使用流行性腹瀉－傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗在妊娠后期進(jìn)行后海穴注射免疫，免疫2次。
2 臨床癥狀 育肥豬、保育豬與母豬呈水樣腹瀉，糞便呈水泥漿樣或黃色。哺乳仔豬通常在出生后12小時(shí)內(nèi)出現(xiàn)嘔吐（圖1），隨后開始腹瀉，糞便常呈黃色、棕色、白色等，顏色不一（圖2），脫水后畏寒，迅速發(fā)生死亡（圖3），7日齡內(nèi)的豬只發(fā)病率幾乎100％，死亡率高達(dá)70～80％（圖4）。腹瀉的保育豬消瘦，體表常被稀糞污染，扎堆（圖5）。哺乳母豬腹瀉時(shí)或腹瀉康復(fù)期后，常出現(xiàn)乳房萎縮，奶水不足（圖6）。 3 病因診斷 3.1 剖檢病變 豬場(chǎng)A與豬場(chǎng)B發(fā)病仔豬的共同病變?nèi)缦拢好撍畤?yán)重，皮膚無彈性（圖2）。胃內(nèi)充滿未消化的乳糜（圖7）。小腸空虛，腸壁變薄，常充滿氣體(圖8)。腎臟表面散布著大量的針尖狀出血點(diǎn)（圖9），其它臟器無顯著一致性病變。但豬場(chǎng)A多頭仔豬的腎盂內(nèi)有大量的結(jié)晶物（圖10），可能與在哺乳母豬飼料中添加大量的磺胺類藥物有關(guān)。 3.2 實(shí)驗(yàn)室診斷 3.2.1 病料采集。豬場(chǎng)A：采集以下病料 a.發(fā)病仔豬的小腸及其內(nèi)容物；b：康復(fù)10～12天的后備母豬、1胎次母豬及經(jīng)產(chǎn)母豬的糞便；c：正在發(fā)病的20日齡仔豬的糞便；豬場(chǎng)B：采集發(fā)病仔豬的小腸及內(nèi)容物。疫苗樣品：某品牌的流行性腹瀉與傳染性胃腸炎二聯(lián)活疫苗。 3.2.2 病料預(yù)處理。仔豬小腸：剪取2cm腸管，剪碎，用PBS 以1:10的重量體積比進(jìn)行稀釋后勻漿，混合物于4℃ 2000g離心15min，收集上清液，立即提取RNA。糞便樣品：用PBS 以1:10的重量體積比進(jìn)行稀釋后，渦旋混勻，該混合物于4℃ 2000g離心15min，收集上清液，立即提取RNA。 3.2.3 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄：按照Geneaid公司病毒核酸提取試劑盒說明書提取RNA。根據(jù)寶生物工程(大連)有限公司RT-PCR試劑盒（TaKaRa Code：DRR036A）說明，采用10μL的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：5×RT Master Mix 2μL、Total RNA 4μL、RNase Free dH2O 4μL，混勻后，于PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：37℃ 15min，85℃ 5 min。 3.2.4 PCR檢測(cè)：1）PEDV的檢測(cè)：根據(jù)GeneBank收錄的PEDV M基因c DNA序列(登陸號(hào)JF690778.1)，設(shè)計(jì)合成引物，用于擴(kuò)增PEDV的M基因片段(317bp)。引物序列如下：M1：5’-CATTCGGTTGTGGCGCAGGAC-3’(M基因297~317)；M2：5’-CGCCGTGTTTGGACCGGACATA-3’(M基因592~613)。采用20μL的PCR反應(yīng)體系，混勻后進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為:95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，59℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5min。1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。
2) TEGV的檢測(cè)：與PEDV的檢測(cè)過程類似。所擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度為：792bp。 3.2.5 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果 從圖11可知，豬場(chǎng)A與豬場(chǎng)B腹瀉仔豬的腸管樣品均是流行性腹瀉病毒呈陽性，傳染性胃腸炎病毒呈陰性。而P-D二聯(lián)活疫苗呈傳染性胃腸炎與流行性腹瀉雙陽性。圖12可知，腹瀉仔豬的糞便樣品呈流行性腹瀉病毒陽性，而腹瀉結(jié)束后10～12天的生長(zhǎng)育肥豬、后備母豬、一胎母豬及經(jīng)產(chǎn)母豬的糞便樣品均呈流行性腹瀉病毒陰性。說明處于康復(fù)期（腹瀉結(jié)束后10左右）的豬只不再通過消化道途徑向環(huán)境中排毒。 根據(jù)臨床癥狀、剖檢病變及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)可判斷：這兩例哺乳仔豬腹瀉均是由流行性腹瀉病毒感染所導(dǎo)致。 4 控制措施 目前針對(duì)流行性腹瀉尚無特異性治療方法，疫苗緊急免疫效果也不佳，建議多采取支持性治療。 4.1 哺乳仔豬 a.保溫：做好產(chǎn)房，特別是保溫箱等局部的保溫工作，7日齡內(nèi)的仔豬，產(chǎn)房局部溫度應(yīng)控制在28℃～32℃之間； b.補(bǔ)液：利用5％的葡萄糖生理鹽水（提前預(yù)熱至35℃）進(jìn)行腹腔補(bǔ)液，每次30毫升，每天2～3次； c.防饑餓：當(dāng)哺乳母豬奶水較差時(shí)，應(yīng)及時(shí)進(jìn)行交叉寄養(yǎng)或采用米湯水或人工乳進(jìn)行人工飼喂，防止仔豬餓死； d.生物安全與清潔衛(wèi)生：減少人員流動(dòng)，加強(qiáng)衛(wèi)生消毒措施，并注意控制產(chǎn)房?jī)?nèi)的濕度（40％～80％之間）。 4.2 保育仔豬、生長(zhǎng)育肥豬 a.適當(dāng)限飼：在腹瀉期間，將發(fā)病豬群的飼料添加量降低為正常水平的三分之一，盡量使用濕拌料。 b.加強(qiáng)補(bǔ)液，防止仔豬脫水，添加電解多維，防止酸中毒，適當(dāng)?shù)奶砑右恍┛股兀缃鹈顾?、阿莫西林等，防止大腸桿菌或沙門氏菌等繼發(fā)感染。同時(shí)，做好保溫與衛(wèi)生消毒工作。 4.3 后備母豬、妊娠母豬及哺乳母豬 a.返飼：利用發(fā)病24小時(shí)內(nèi)的哺乳仔豬小腸管及其內(nèi)容物、糞便等破碎，勻漿后，加上一定劑量抗生素（如青鏈霉素、慶大霉素、新霉素等）后，分兩批次進(jìn)行返飼，并及時(shí)進(jìn)行返飼效果跟蹤判斷；（具體方法見下文敘述）。 b.催乳：母豬腹瀉后，常出現(xiàn)奶水不足的狀況，造成仔豬大量死亡?？赏ㄟ^調(diào)整哺乳料的營(yíng)養(yǎng)水平或添加催乳劑等飼料添加劑來增加母豬奶水。 5 討論與小結(jié) 5.1 豬流行性腹瀉 豬流行性腹瀉是由冠狀病毒（豬流行性腹瀉病毒）感染所導(dǎo)致一種以水樣腹瀉、豬只逐漸消瘦為主要特征的病毒性疾病?？筛腥靖魃L(zhǎng)階段的豬只，在歐洲該病對(duì)斷奶仔豬與生長(zhǎng)育肥豬的影響較大，對(duì)哺乳仔豬的影響比較溫和（即使沒有PED母源抗體存在）[2]，但在亞洲該病對(duì)哺乳仔豬的影響非常大，死亡率可高達(dá)80％以上。好發(fā)于冬春寒冷季節(jié)，但2011年山東以南各省份全年均有急性病例，東北三省的發(fā)病率相對(duì)較低。主要臨床癥狀為豬只食欲減退、嘔吐、腹瀉、脫水、甚至死亡。剖檢主要病變?yōu)槟c壁（特別是小腸壁）變薄甚至呈半透明狀，胃內(nèi)常充滿未消化的凝乳塊[2]。其臨床癥狀、剖檢變化與傳染性胃腸炎非常相似。與之前的報(bào)道所不同的是：在這兩個(gè)病例中均發(fā)現(xiàn)腎臟表面散布著大量的針尖狀小出血點(diǎn)。但通過RT-PCR檢測(cè)確定豬場(chǎng)A與豬場(chǎng)B的仔豬腸管樣品中均呈流行性腹瀉病毒陽性。此檢測(cè)結(jié)果與Sun RQ等人[1] 在2010～2011年對(duì)我國(guó)9家規(guī)?；i場(chǎng)病毒性腹瀉的檢測(cè)結(jié)果一致[1]，導(dǎo)致10日齡內(nèi)哺乳仔豬的發(fā)病率與死亡率高達(dá)80％。據(jù)國(guó)際獸醫(yī)局（OIE）調(diào)查，豬流行性腹瀉與豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合征是近年來影響亞太地區(qū)養(yǎng)豬工業(yè)最重要的兩種疾病[3]。 流行性腹瀉病毒（PEDV）主要通過糞便進(jìn)行傳播，也可通過患病哺乳母豬的奶水進(jìn)行傳播[1]，通過糞－口途徑進(jìn)行感染。經(jīng)檢測(cè)，這兩個(gè)發(fā)病豬場(chǎng)的患病仔豬糞便均呈PEDV陽性，但豬場(chǎng)A康復(fù)10～12日后妊娠母豬與哺乳母豬糞便樣品均呈PEDV陰性，說明康復(fù)10日后，豬只不再向外界環(huán)境排毒。DaeSub Song等人[4]使用Vero細(xì)胞致弱的PEDV通過口服方式人工感染2周齡的哺乳仔豬與妊娠后期母豬，發(fā)現(xiàn)仔豬通過糞便最長(zhǎng)病毒排毒時(shí)間為感染后的第9天，而母豬最長(zhǎng)的向外排毒時(shí)間為感染后的第3天。兩者的結(jié)論一致，但野毒對(duì)外排毒的持續(xù)期可能比致弱毒株要長(zhǎng)些[5]。在本案例中，這些康復(fù)母豬所分娩的新生仔豬依舊發(fā)病了，可能原因如下：第一，因棟舍設(shè)計(jì)限制，本豬場(chǎng)在發(fā)病期間也無法做到全進(jìn)全出，加之消毒措施不徹底，環(huán)境中存在的PED病毒會(huì)感染新生仔豬；第二，雖然康復(fù)母豬或經(jīng)過返飼（豬場(chǎng)A）的母豬已產(chǎn)生了母源抗體，但哺乳母豬的奶水普遍不佳（圖6），無法通過奶水中的母源抗體來保護(hù)新生仔豬。 5.2 豬流行性腹瀉疫苗與免疫失敗原因分析 開發(fā)高效的豬流行性腹瀉疫苗是當(dāng)前科學(xué)界面臨的一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。在本次疫情中，雖然兩豬場(chǎng)在妊娠母豬分娩前利用流行性腹瀉－傳染性胃腸炎二聯(lián)滅活疫苗（疫苗毒株：CV777）進(jìn)行跟胎免疫，但豬群發(fā)病快，仔豬死亡率高，說明當(dāng)前所用疫苗的保護(hù)率不佳。主要的原因可能如下：1）疫苗毒株：流行性腹瀉病毒變異較快，各國(guó)的疫苗毒株也有所不同，如日本：P-5V，韓國(guó)：KPEDV-9[6]。冠狀病毒的纖突蛋白（S）基因變異性高且能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體[ 7]。據(jù)Sun RQ等人[1]報(bào)道,2010～2011年所檢測(cè)的仔豬流行性腹瀉病毒S基因部分片段與疫苗株CV777之間的同源性為93.3%～94.7％，基因系統(tǒng)進(jìn)化分析表明：新病毒株與以往的毒株及疫苗株均有所不同。2）疫苗類型：目前已商品化的疫苗包括滅活疫苗與活疫苗兩類，我國(guó)以滅活疫苗為主，而韓國(guó)與日本以商品化的流行性腹瀉活疫苗為主[8]。3）免疫途徑：目前我國(guó)所使用的滅活疫苗采用后海穴注射免疫。但實(shí)驗(yàn)證明：利用Vero細(xì)胞致弱的流行性腹瀉活疫苗通過不同免疫途徑對(duì)懷孕后期母豬進(jìn)行免疫,口服免疫組的死亡率(13%)明顯低于肌肉注射組（60％），口服免疫組仔豬體內(nèi)的IgA抗體的濃度更高[9]。4）抗原含量：流行性腹瀉病毒對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻，要達(dá)到有效的抗原滴度也存在一定的挑戰(zhàn)。 5.3 流行性腹瀉的復(fù)發(fā)與返飼技術(shù)應(yīng)用 在本次疫病流行過程中，多家規(guī)?；i場(chǎng)報(bào)告其豬場(chǎng)在一個(gè)月時(shí)間內(nèi)連續(xù)兩次爆發(fā)流行性腹瀉。這可能因?yàn)樵谑状胃腥緯r(shí)，母豬群未被全部感染，存在一定比例的易感（空白）豬只，使得流行性腹瀉病毒得以再次感染易感豬群。美國(guó)、加拿大等國(guó)家在藍(lán)耳病爆發(fā)時(shí)，很多豬場(chǎng)管理人員為了縮短藍(lán)耳病對(duì)豬群的感染期會(huì)使用已發(fā)病豬只的血清對(duì)全群豬進(jìn)行同期感染。而在流行性腹瀉與傳染性胃腸炎的控制上，因商品化疫苗效果欠佳，返飼技術(shù)被廣泛使用且取得了較好的效果，兩者的免疫機(jī)理基本類似。所謂的返飼技術(shù)就是采用新發(fā)病哺乳仔豬的腸管、糞便等（發(fā)病24小時(shí)內(nèi)采集病料最佳）病毒攜帶物通過口服方式感染母豬群，使其通過自然感染的途徑產(chǎn)生免疫，新生仔豬通過母乳獲得特異性母源抗體而獲得保護(hù)。 5.4 展望 雖然目前已通過基因序列分析發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致2010～2012年的流行性腹瀉疫情的毒株與以往毒株有所不同，但因分離培養(yǎng)技術(shù)與條件的限制，目前僅有少數(shù)的實(shí)驗(yàn)室能夠分離培養(yǎng)該毒株。新毒株的成功分離培養(yǎng)與人工致弱將大力推動(dòng)我國(guó)流行性腹瀉活疫苗的研發(fā)進(jìn)程。其次，可進(jìn)一步研究新毒株基因變異狀況，以確定基因變異對(duì)病毒毒力、免疫原性及交叉保護(hù)性的影響。此外，雖然在2011年，該病波及我國(guó)的各養(yǎng)豬大省，但南方的發(fā)病率與仔豬死亡率明顯高于東北三省?？茖W(xué)有效的流行病學(xué)調(diào)查，有利于揭示該病流行的流行特點(diǎn)與致病條件。 參考文獻(xiàn) [1] Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, et al. Outbreak of Porcine Epidemic Diarrhea in Suckling Piglets, China[J]. Emerging Infectious Diseases. 2012,18(1):161-162. [2] Barbara E Straw, Jeffery J Zimmerman, David J Taylor. 豬病學(xué)[M].趙德明，張仲秋，沈建忠譯.第九版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008:827-840. [3] R.G. Morales, A.C. Umandal, C.A. Lantican. Emerging and re-emerging diseases in Asia and the Pacific with special emphasis on porcine epidemic diarrhea[M]. Conference OIE. 2007: 185-189. [4]DaeSub Song, JinSik Oh, BoKyu Kang,et al. Fecal shedding of a highly cell-culture-adapted porcine epidemic diarrhea virus after oral inoculation in pigs[J] Journal of Swine Health and Production. 2005,13(5): 269–272. [5]Song DS, Yang JS, Oh JS, et al.Differentiation of a Vero cell adapted porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorphism analysis of ORF3[J]. Vaccine. 2003,21:1833–1842. [6]Jiménez G, Correa I, Melgosa MP,et al. Critical epitopes in transmissible gastroenteritis virus neutralization[J]. Journal of Virology. 1986,60:131–139. [7]D.S. Song, J.S. Oh, B.K. Kang, et al. Oral efficacy of Vero cell attenuated porcine epidemic diarrhea virus DR13 strain[J]. Research in Veterinary Science. 2007,82:134-140. [8] Kadoi, K., Sugioka, H., Satoh, T.,et al. The propagation of a porcine epidemic diarrhea virus in swine cell lines[J]. Microbiology.2002, 25: 285–290. [9] Olanratmanee, Annop Kunavongkrit, Padet Tummaruk. Impact of porcine epidemic diarrhea virus infection at different periods of pregnancy on subsequent reproductive performance in gilts and sows[J]. Animal Reproduction Science. 2010,122 (1-2): 42-51. |
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