慢病毒載體（Lentiviral vector, LVs）是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，它能高效將目的基因（或RNAi）導(dǎo)入動(dòng)物和人的原代細(xì)胞或細(xì)胞系。慢病毒載體基因組是正鏈 RNA，其基因組進(jìn)入細(xì)胞后，在細(xì)胞漿中被其自身攜帶的反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為DNA，形成DNA整合前復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核后，DNA整合到細(xì)胞基因組中。整合后 的DNA轉(zhuǎn)錄mRNA，回到細(xì)胞漿中，表達(dá)目的蛋白；或產(chǎn)生RNAi干擾。
慢病毒載體介導(dǎo)的基因表達(dá)或RNAi干擾作用持續(xù)且穩(wěn)定，原因是目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，并隨細(xì)胞基因組的分裂而分裂。另外，慢病毒載體能有效感 染并整合到非分裂細(xì)胞中。以上特性使慢病毒載體與其它病毒載體相比，比如不整合的腺病毒載體、整合率低的腺相關(guān)病毒載體、只整合分裂細(xì)胞的傳統(tǒng)逆轉(zhuǎn)錄病毒 載體，有鮮明的特色。大量文獻(xiàn)研究表明，慢病毒載體介導(dǎo)的目的基因長期表達(dá)的組織或細(xì)胞包括腦、肝臟、肌肉、視網(wǎng)膜、造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、巨噬 細(xì)胞等。
慢病毒載體不表達(dá)任何HIV-1蛋白，免疫原性低，在注射部位無細(xì)胞免疫反應(yīng)，體液免疫反應(yīng)也較低，不影響病毒載體的第2次注射（Kafri, T., U. Blomer, D.A. Peterson, F.H. Gage, and I. M. Verma. 1997. Sustained expression of genes delivered directly into liver and muscle by lentiviral vectors. Nat. Genet. 17:314-317）。

慢病毒載體應(yīng)用

• 將目的基因/RNAi基因轉(zhuǎn)入難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，比如神經(jīng)元細(xì)胞、干細(xì)胞或其它原代細(xì)胞
• 將目的基因/RNAi基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物組織，以期獲得長期表達(dá)
• 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白/RNAi的細(xì)胞系，再用ex vivo的方法導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)
• 基因治療
• 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
• 基因敲除
• 藥物研究：構(gòu)建表達(dá)受體蛋白的細(xì)胞系，研究藥物的作用
• 快速建立生產(chǎn)目的蛋白的細(xì)胞系，非常有前途的真核細(xì)胞表達(dá)方法

本元正陽慢病毒載體系統(tǒng)
本元正陽生產(chǎn)的慢病毒載體屬于“第三代”慢病毒載體，其基因組的3’ LTR的增強(qiáng)子功能發(fā)生了缺失，從而形成了所謂的“自滅活”（Self-inactivation，SIN），即該病毒基因組整合到細(xì)胞基因組后，不會(huì)產(chǎn) 生新的子代病毒，也降低了對周圍基因的意外激活，因此具有較好的安全性。病毒的包膜上嵌合了來自水泡口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus）的VSV-G蛋白，使病毒能感染更多種細(xì)胞（包括分裂和非分裂細(xì)胞），且病毒更趨穩(wěn)定。（Dull, T., Zufferey, R., et al., A Third-generation Lentivirus Vector with a Conditional Packaging System, J. Virol., 1998, 72,8463-8471）慢病毒載體結(jié)構(gòu)見圖1。

HIV-1 genome

LVs vector
 

與HIV-1相比，慢病毒載體改造包括以下部分：
1、5’ LTR的U3區(qū)被RSV的enhancer/promoter取代，3’ LTR的U3區(qū)缺失；
2、HIV-1的全部9種蛋白，包括gag、pol、env等從載體基因組中缺失；
3、目的基因由CMV啟動(dòng)子控制，SV40啟動(dòng)子控制抗性基因BSD（Blasticidin）或報(bào)告基因EGFP。

包裝容量
野生型HIV-1基因組的長度為10kb，本慢病毒載體的外源基因的插入總長度不能超過6kb（包括Blasticidin的表達(dá)盒及目的基因的表達(dá)盒），其中目的基因的長度不宜超過4.3kb，否則將影響病毒包裝效率。

安全性

• 刪除了全部HIV-1的編碼基因，在介導(dǎo)目的基因的表達(dá)時(shí)，沒有任何HIV-1蛋白的表達(dá)；
• 對5’和3’ LTR分別進(jìn)行了刪除改造，5’LTR缺失U3，換上RSV enhancer/promoter，使載體的復(fù)制不再依賴Tat；3’LTR刪除U3，使其不再有啟動(dòng)/增強(qiáng)活性，成為自滅活（self-inactivating, SIN）載體；
• 病毒包裝必需的3個(gè)蛋白Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替HIV-1的Env）分別獨(dú)立放置在3個(gè)質(zhì)粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相之間沒有任何同源序列，大大降低了復(fù)制型慢病毒（RCL）的產(chǎn)生幾率；
• 與MuLV等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體相比，慢病毒載體的整合更偏向于宿主細(xì)胞基因組的基因表達(dá)活躍區(qū)，激活沉默的原癌基因的幾率可能比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體低；
• 慢病毒載體未發(fā)現(xiàn)有致腫瘤活性，而MuLV等逆轉(zhuǎn)錄病毒載體有致瘤活性（Eugenio Montini, Daniela Cesana, et al., Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration, Nature Biotechnology, 2006, 24:687-696）；
• 慢病毒的LTR的轉(zhuǎn)錄激活能力低于逆轉(zhuǎn)錄病毒，激活原癌基因能力也相對較低；
• 全世界有4千萬人感染了HIV-1，發(fā)生的整合事件不計(jì)其數(shù)，但未出現(xiàn)一起致瘤事件；

實(shí)驗(yàn)室安全措施
慢病毒載體已經(jīng)被全世界許多實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，沒有出現(xiàn)過任何意外，但仍具有潛在的產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒（RCL）和致癌的風(fēng)險(xiǎn)，操作者在實(shí)驗(yàn)中仍需要保持高度警惕！
所有操作均應(yīng)盡量在BSL2級生物安全柜中進(jìn)行，并佩戴一次性口罩和手套，尤其要避免病毒接觸口、眼、鼻、耳、傷口等身體開放性區(qū)域，避免產(chǎn)生氣溶 膠，tip頭一定要選擇帶有濾芯的。必須高度注意被污染的尖銳物品，包括針頭、注射器、載玻片、移液管、毛細(xì)玻璃吸管和解剖刀。每次實(shí)驗(yàn)后，立即清理所有 接觸過病毒的器具，均應(yīng)高壓消毒再進(jìn)行下一步處理。顯微鏡臺(tái)、生物安全柜臺(tái)面等使用后，用70%乙醇擦拭。意外灑落的含病毒的液體，用衛(wèi)生紙吸干后，用 0.6%次氯酸鈉溶液浸泡被污染處1h。裝盛慢病毒載體的實(shí)驗(yàn)用品，要單獨(dú)放置，標(biāo)示清楚，并標(biāo)注“危險(xiǎn)品”字樣。盡量使用培養(yǎng)瓶，不要使用培養(yǎng)板來感染 病毒，以防意外灑落。對共用實(shí)驗(yàn)室的人員進(jìn)行慢病毒安全培訓(xùn)或提示。

生產(chǎn)流程

• 含目的基因的載體質(zhì)粒pLenti-gene的構(gòu)建和純化提??；
• pLenti-gene、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；
• 培養(yǎng)48~72h，收集培養(yǎng)上清；
• 病毒載體的純化和濃縮（超離和/或超濾）；
• 分裝、-80℃保存；
• 滴度測定、目的基因檢定；
• 出具檢測報(bào)告；
• 干冰運(yùn)輸發(fā)貨

保存、使用和運(yùn)輸
慢病毒載體在-80℃保存6個(gè)月，滴度不會(huì)明顯下降。建議保存6~12個(gè)月以上的樣品，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，重新測一次滴度。應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。
使用前從-80℃取出病毒，立即放在37℃水浴鍋中，輕輕晃動(dòng)，使其盡快溶解。用不完的病毒可以暫時(shí)放在4℃冰箱中，但最好盡快用完，根據(jù)我們的經(jīng)驗(yàn)，4℃放置1周，滴度會(huì)有4~5倍的下降。
對于長距離運(yùn)輸，應(yīng)先將慢病毒載體保存在-80℃，再采用全程干冰運(yùn)輸，以防滴度下降。

質(zhì)量控制
本元正陽對病毒載體的生產(chǎn)一貫采用全程監(jiān)控的方式，以確保產(chǎn)品質(zhì)量。您得到慢病毒產(chǎn)品的同時(shí)，將同時(shí)獲得以下質(zhì)量指標(biāo)：

• 載體質(zhì)粒構(gòu)建檢測
• 產(chǎn)品無菌檢測
• 滴度檢測
  物理滴度：p24 ELISA法/或RNA qRT-PCR法
  活性滴度：感染293后，GFP熒光FACS計(jì)數(shù)法/或qPCR法
• 目的基因的PCR檢測

感染和分析
瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)
瞬時(shí)表達(dá)：本產(chǎn)品感染細(xì)胞后，至少要培養(yǎng)24~48小時(shí)才能檢測目的基因的表達(dá)。原因是慢病毒載體的基因組是RNA，需要反轉(zhuǎn)錄為DNA，并插入細(xì)胞染色體后產(chǎn)能表達(dá)。
穩(wěn)定表達(dá)：本產(chǎn)品攜帶了Blasticidin（一種抗生素基因）的基因，如果用Blasticidin藥物進(jìn)行加壓篩選，10~12天后可獲得穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞克隆。

感染細(xì)胞最佳MOI的測定
MOI（Multiplicity of Infection，感染復(fù)數(shù)）是指每個(gè)細(xì)胞感染的病毒數(shù)，通常MOI越高，病毒整合到染色體的數(shù)量以及目的蛋白的表達(dá)量越高。
對于分裂活躍的細(xì)胞，比如Hela、293細(xì)胞，MOI=1時(shí)，80%以上的細(xì)胞均表達(dá)目的基因。而對于非分裂細(xì)胞，比如原代細(xì)胞，感染效率較低。我們建 議通過比較不同MOI（比如0、1、5、10、50、100等），選擇適合的MOI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（可以考慮選用攜帶報(bào)告基因的病毒，比如Lenti- EGFP）。

感染方法

• 按實(shí)驗(yàn)需要將細(xì)胞鋪板（比如24孔板）。細(xì)胞數(shù)以第2天密度約50%為宜。37℃ 培養(yǎng)過夜。
• 感染前，從冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，用新鮮完全培養(yǎng)基稀釋成所需濃度。注意：輕輕混勻，不要使用振蕩器。
• 吸去細(xì)胞原有培養(yǎng)基，將稀釋好的病毒液加入細(xì)胞中。
• 加入Polybrene（對于293細(xì)胞，終濃度6mg/ml，其它細(xì)胞可以按注1的方法確定合適的濃度），輕輕搖勻。37℃培養(yǎng)過夜。
• 感染后第二天，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換上新鮮的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。（或感染6小時(shí)后換液）
• 感染后第三天，根據(jù)需要，或收集細(xì)胞檢測目的蛋白的表達(dá)，或換上含適當(dāng)濃度的Blasticidin的新鮮完全培養(yǎng)液，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞株。
• 每3~4天換含Blasticidin的完全培養(yǎng)液一次。
• 換上Blasticidin后10~12天，抗Blasticidin的細(xì)胞克隆將形成。
• 挑選至少5個(gè)克隆，進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增后，檢測目的蛋白的表達(dá)。

Blasticidin的濃度篩選方法
一般情況下，2~10mg/ml的Blasticidin足以殺死大部分類型的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株。建議用0、2、4、6、8、10mg/ml的 Blasticidin培養(yǎng)待測試細(xì)胞，每3~4天換液一次，選擇10天內(nèi)殺死所有細(xì)胞的最低Blasticidin濃度作為工作濃度。針對293細(xì)胞， 我們推薦Blasticidin終濃度為6 mg/ml。

注：

• Polybrene:（Sigma公司產(chǎn)品，Cat. No. H9268）是帶正電的小分子，與細(xì)胞表面的陰離子結(jié)合，提高慢病毒對細(xì)胞的感染效率。Polybrene有一定的細(xì)胞毒性，不同細(xì)胞對 polybrene的敏感度不同，可以用1~10mg/ml的范圍篩選合適的濃度，以24h內(nèi)細(xì)胞無明顯毒性反應(yīng)為佳。如果無法找到無細(xì)胞毒性的合適濃 度，可以不加。通常加入polybrene能提高感染效率2~10倍。配制方法：用無菌去離子水溶解Polybrene，濃度為6mg/ml。過濾除菌， 分裝成1ml/支。保存在-20℃（可保存1年以上），避免反復(fù)凍融3次以上，否則活性受影響。4℃可保存2周。
• Blasticidin（Merk Index：12：1350，分子量458.9，分子式：C17H26N8O5- HCl）（10mg/ml儲(chǔ)存液）：用無菌去離子水溶解BSD，濃度為5~10mg/ml。過濾除菌，分裝成一次用量，保存在-20℃（可保存6~8 周），4℃可保存1周。避免反復(fù)凍融，不要保存在無霜冰箱中。培養(yǎng)液中的BSD在4℃可保存2周。另外，pH高于7.0會(huì)使BSD失活。
• 常用慢病毒滴度檢測方法比較