一、基因疫苗的誕生

    疫苗的誕生為人類防治疾病帶來了革命性的變化，它的發(fā)展主要經(jīng)歷了三代：第一代疫苗是傳統(tǒng)疫苗，即弱毒活苗和滅活苗，如雞新城疫弱毒苗，豬瘟滅活苗，它是直接將無毒或減毒的病原體作為疫苗接種到人或動物體內(nèi)，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性免疫應答，從而預防疾病的發(fā)生；第二代疫苗是基因工程苗，它是通過基因工程，先分離得到具有強烈免疫原性但無毒性的抗原蛋白的編碼基因，然后導入表達載體中，再在宿主細胞表達出重組抗原蛋白，經(jīng)分離純化后的重組抗原蛋白作為疫苗接種如重組乙肝疫苗；第三代疫苗是基因疫苗。

    基因疫苗（genetic vaccine）又稱核酸疫苗(nucleic acid vaccine)或DNA疫苗，是在基因治療（genetic therapy）技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的?；蛑委熓菑?0世紀80年代發(fā)展起來用于預防和治療疾病的最具革命性的生物醫(yī)學醫(yī)療技術(shù)，其原理是將人或動物的正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入人體靶細胞以糾正基因的缺陷或發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的。1990年Wolff JA等在進行基因治療試驗時，以裸DNA注射作對照，結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)裸DNA可被骨骼肌細胞吸收并表達出外源性蛋白。1992年Tang.DC等首次證明經(jīng)基因免疫產(chǎn)生的外源性蛋白質(zhì)——人生長激素可刺激小鼠免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性抗體，而且加強免疫后抗體效價增加，從而宣告基因疫苗的誕生。

概括起來，基因疫苗就是指將編碼外源性抗原的基因插入到含真核表達系統(tǒng)的載體上，然后直接導入人或動物體內(nèi)，讓其在宿主細胞中表達抗原蛋白，該抗原蛋白可直接誘導機體產(chǎn)生免疫應答。抗原基因在一定時限內(nèi)的持續(xù)表達，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生應答反應，從而達到預防疾病的目的。

    二、基因疫苗質(zhì)粒載體的構(gòu)建

    獲得準確的抗原編碼基因并將它插入到合適的載體DNA上，是發(fā)展基因疫苗的主要工作。

    1編碼抗原蛋白基因的分離

    制備DNA疫苗首先要獲得編碼抗原的基因，一般選擇編碼病原體表面糖蛋白的基因?？乖鞍桩a(chǎn)生后可在宿主體內(nèi)正確糖基化，從而誘導對病原體的免疫應答反應；對于易變異的病原體，最好選擇各種變型都具有的核心蛋白保守的DNA序列，這樣可對各種變異的病原體產(chǎn)生免疫應答反應，避免因病原體變異產(chǎn)生的免疫逃避問題。目前普遍用表達文庫免疫（ELI）技術(shù)從各種已知或未知的病原體基因組中獲得免疫活性基因。ELI是將病原體基因文庫中病原體DNA 片段插入特定的質(zhì)粒中，再利用基因免疫技術(shù)篩選病原體基因組中具有免疫保護功能的基因片段。

    首先提取出病原體的DNA或RNA，并將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，然后通過PCR得到目的基因的DNA片段，并插入合適的酶切位點以便下一步克隆。

    2 目的基因質(zhì)粒的載體構(gòu)建

    基因疫苗大多采用質(zhì)粒作載體。一般說來，基因疫苗質(zhì)粒載體至少包括5個主要的部件：（1）細菌復制子，以便質(zhì)粒DNA在細菌體內(nèi)復制擴增，得到大量的拷貝，但不能在宿主細胞（真核細胞）中復制；（2）原核生物選擇性標記基因，如抗生素抗性基因，以篩選含有質(zhì)粒DNA的陽性細菌克?。ň辏唬?）真核生物的啟動子、增強子、終止子、內(nèi)含子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件；（4）編碼抗原蛋白的目的基因序列；（5）多聚核苷酸信號序列，以保證mRNA翻譯時適時終止。另外，基因疫苗質(zhì)粒載體通常含有一段未甲基化的CpG序列，其具有刺激Th1細胞的免疫活性。

三、基因疫苗的免疫方法

    1、直接注射法：裸質(zhì)粒DNA或經(jīng)脂質(zhì)體包裹的裸質(zhì)粒DNA直接從肌肉、皮內(nèi)、皮下、粘膜、靜脈內(nèi)注射。包裹DNA的脂質(zhì)體能與組織細胞發(fā)生膜融合，而將DNA攝入，減少了核酸酶對DNA的破壞?！?/P>

    2、基因槍轟擊法：將質(zhì)粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍將包被DNA的金微粒子高速穿入組織細胞。這種方法效率高，免疫應答強烈，但操作復雜，需特殊設備?！?/P>

    3、細菌或病毒攜帶法：選擇一種容易進入某組織器官的細菌或病毒，將其繁殖基因去掉形成繁殖缺陷菌株，然后將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到該細菌或病毒中，當這些細菌或病毒進入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放出質(zhì)粒DNA。

    4、口服、噴鼻或滴鼻法。

    四、基因疫苗的免疫應答反應和影響因素

    質(zhì)粒DNA在細胞內(nèi)表達的多肽抗原與宿主的MHCI和MHCⅡ類分子結(jié)合后，提呈給免疫活性細胞(ICC)，誘導多種免疫反應（圖1）：一是體液免疫反應；二是細胞毒素T淋巴細胞免疫反應；三是輔助T細胞反應。有關(guān)抗原蛋白產(chǎn)生的免疫應答機理還不太清楚

    影響基因疫苗效果的因素很多，主要有：

    （1）質(zhì)粒載體骨架機構(gòu)：一般說來，質(zhì)粒中內(nèi)含子序列、多聚A序列和免疫刺激序列，都會影響免疫效果。

    （2）免疫質(zhì)粒DNA的給藥劑量和導入細胞的效率：免疫的劑量越大，進入細胞的DNA就越多，產(chǎn)生的免疫效果越好。

    （3）抗原蛋白在宿主細胞的表達效率。

    （4）免疫次數(shù)、注射方式和給藥途徑。

    五、基因疫苗的優(yōu)點和存在的問題

    與傳統(tǒng)疫苗相比，基因疫苗具有以下顯著的優(yōu)越性：　  

    1、質(zhì)粒DNA非常穩(wěn)定，易于貯存和運輸，使用方便。而且制備簡單，容易大量生產(chǎn)，成本低。對于毒性大、危險的病毒，以及難以提取抗原的疫苗，基因疫苗的制備相對安全，容易得多。

    2、質(zhì)粒DNA在宿主體內(nèi)可較長時間存在，抗原基因在體內(nèi)持續(xù)表達產(chǎn)生抗原蛋白，不斷刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生長程免疫，免疫效果可靠。

    3、基因疫苗不僅可以產(chǎn)生體液免疫應答，而且可以導致細胞毒素T淋巴細胞激活而誘導細胞免疫，而傳統(tǒng)的疫苗只有活苗可誘導細胞免疫，但存在活疫苗的毒力回升的危險。

    4、用核心蛋白保守DNA序列制備的基因疫苗對病原體（細菌或病毒）的各變異亞型都可產(chǎn)生免疫應答，從而避免因病原體變異而造成的免疫逃避問題。

    5、一個質(zhì)粒載體可克隆多個抗原基因組成多價苗，從而一種基因疫苗可預防多種疾病。

    6、質(zhì)粒DNA無免疫原性，不會像重組疫苗那樣誘發(fā)針對載體的自身免疫反應，至少目前沒有檢測到抗DNA抗體的報道。另外，基因疫苗還不會受機體已有抗體的影響。

    作為一類新型疫苗，基因疫苗還有不少需要進一步研究的問題：

    1、安全性問題：質(zhì)粒DNA一般不會整合到宿主細胞的基因組上，目前也未發(fā)現(xiàn)插入突變的證據(jù)。但不能完全排除少數(shù)質(zhì)粒DNA插入到染色體上引起突變的可能性。一旦整合到基因組中就可能使細胞癌基因激活或抑癌基因失活

    2、保護效率問題：目前為止，基因疫苗的免疫效率很難達到百分之百的免疫保護，且存在明顯的種屬個體差異，這可能與不同動物細胞需要不同啟動子、抗原基因、給藥方法途徑、給藥量有關(guān)。

    3、免疫耐受問題：基因疫苗體內(nèi)持續(xù)表達產(chǎn)生抗原蛋白，可能打破機體本身的免疫平衡，引發(fā)免疫耐受。