包涵體蛋白的純化和復(fù)性

1．菌體的收集和破碎

用50 ml離心管分別收集誘導(dǎo)表達后的培養(yǎng)物，8000 rpm 4℃離心10 min。沉淀用適量的超聲破菌緩沖液重懸。

【備注】超聲破菌緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）

重懸后的菌液于冰浴中進行超聲波破碎，其條件為：功率為300W，占空比50%，每個循環(huán)30 s，總時間20 min。破碎后的勻漿， 4℃、 12000 rpm離心15 min。分別取上清液和沉淀進行12% SDS-PAGE分析，確定目的蛋白是否以包涵體的形式表達。

2．包涵體的處理

洗滌：沉淀用適量的包涵體洗滌緩沖液重懸后，攪拌洗滌20~30 min，于4℃，12000 rpm離心15 min，棄去上清液。重復(fù)一次。再用適量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗滌一遍（以去除殘留的EDTA），于4℃ 12000 rpm離心15 min，棄去上清液。

【備注】包涵體洗滌緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）

2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M緩沖液98ml即可。

溶解：沉淀用適量的包涵體溶解緩沖液重懸，室溫攪拌5-6小時或過夜。12000 rpm 4℃離心15 min，收集上清液。

【備注】包涵體溶解緩沖液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巰基乙醇，2％Triton）

3．目的蛋白的純化

    親和層析基于目的蛋白與固相化的配基特異結(jié)合而滯留，其他雜蛋白會流過柱子。

    谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是最常用的親和層析純化標簽之一，帶有此標簽的重組蛋白可用交聯(lián)谷胱甘肽的層析介質(zhì)純化，但本方法有以下缺點：首先，蛋白上 的GST必須能合適的折疊，形成與谷胱甘肽結(jié)合的空間結(jié)構(gòu)才能用此方法純化；其次，GST標簽多達220個氨基酸，如此大的標簽可能會影響表達蛋白的可溶 性，使形成包涵體，這會破壞蛋白的天然結(jié)構(gòu)，難于進行結(jié)構(gòu)分析，有時即便純化后再酶切去除GST標簽也不一定能解決問題。

    另一種可應(yīng)用的親和純化標簽是6組氨酸標簽,組氨酸的咪唑側(cè)鏈可親和結(jié)合鎳、鋅和鈷等金屬離子，在中性或弱堿性條件下帶組氨酸標簽的目的蛋白與鎳柱結(jié)合， 在低pH下用咪唑競爭洗脫。組氨酸標簽與GST相比有許多優(yōu)點：首先，由于只有6個組氨酸，分子量很小，一般不需要用酶切去除；其次，可以在變性條件下純 化蛋白，在高濃度的尿素和胍中仍能夠保持結(jié)合力；另外6組氨酸標簽無免疫原性，重組蛋白可直接用來注射動物，也不影響免疫學(xué)分析。雖然有這么多的優(yōu)點，但 此標簽仍有不足，如目的蛋白易形成包涵體、難以溶解、穩(wěn)定性差及錯誤折疊等。鎳柱純化時金屬鎳離子容易脫落漏出混入蛋白溶液，不但會通過氧化破壞目的蛋白 的氨基酸側(cè)鏈，而且柱子也會非特異吸附蛋白質(zhì)，影響純化效果。若目的蛋白可與某種碳水化合物特異結(jié)合，或者需要某種特殊的輔因子，可將該碳水化合物或輔因 子固相化制成親和柱，結(jié)合后目的蛋白可用高濃度的碳水化合物或輔因子洗脫。

融合蛋白的表達和純化過程：

1.挑單菌落于3-5 ml 2YT或LB 培養(yǎng)中，37℃過夜培養(yǎng)。

2.按1：100的比例取過夜培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接。37℃擴大培養(yǎng)至OD 0.5左右。

3.加入IPTG終濃度0.2～0.4 mM/L。 37℃搖床培養(yǎng)4～6h。

4.12000g離心15min，去上清。按40ml/100ml菌液加入1×Binding Buffer {破碎緩沖液組成： 50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，溶菌酶(10 礸/g cell)，；或 20 mmol/l Tris-HCl, pH 7.5,1mmol/lEDTA, 0.1mM PMSF, DNAse (10 礸/g cell) }細胞破碎緩沖液中不含脲等變性劑，故不溶解包涵體?；?×PBS重懸細胞。

5.超聲波破碎：占空比50％，超聲15s，停15s，10～20min。破碎后的勻漿在4℃，12,000 rpm下離心30 min，棄去上清液。

6.洗滌包涵體：2M尿素在50mM Tris pH7.0～8.5左右,1mM EDTA ，10% Triton X-100中洗滌。洗滌2～4h 去除膜碎片和膜蛋白。8M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA ，10% TritonX-100，二硫鍵還原劑中洗滌。洗滌4～8h，使包涵體變性可溶。

7. 過Ni柱：

Ni^2＋親和層析柱純化

    包涵體溶解后的上清液，用鎳親和層析柱純化。操作過程參照Amersham Pharmacia Biotech公司提供的操作指南進行。具體過程如下：轉(zhuǎn)移樹脂到柱子，待完全沉淀后，用三蒸水洗滌鎳親和層析柱，以除盡基質(zhì)中的乙醇和空氣，并防止下一步Ni^2＋沉淀；5×柱體積的Charge Buffer充電；20×柱體積的三蒸水洗滌，去盡游離的Ni^2＋；10×柱體積的Binding Buffer平衡柱子；手工上樣，根據(jù)蛋白的濃度來確定上樣體積；20×柱體積的Binding Buffer洗滌，至檢出無蛋白，并收集流出液，用于12％SDS-PAGE電泳檢測；6×柱體積的Wash Buffer洗滌，至檢出無蛋白；Elution Buffer洗脫，每次1 mL，收集洗脫流出液，洗脫至檢出無蛋白；10×柱體積的Binding Buffer平衡。此時，即可用于純化同種蛋白，不需重新充電。

    純化操作完成后，加5×柱體積的Strip Buffer洗滌，去盡Ni^2＋；10×柱體積的三蒸水洗滌去盡EDTA；加5×柱體積的0.5 mol/L NaOH，靜置0.5-2 h，去沉淀的蛋白質(zhì)；三蒸水洗滌，至流出液的pH值為7.0；20％乙醇洗滌，再加適量20％乙醇，于4℃保存。

A、過柱前的注意事項：

a、樣品必須澄清、無顆粒物，否則會堵塞柱子、縮短其使用壽命；

b、包含體洗滌的最后一步及溶解時所用的Buffer中不能含EDTA、DTT、2ME；

c、確保樣品及Binding Buffer中有適量的NaCl，以防止雜離子與Ni離子競爭；

B、過Ni柱的操作步驟：

①用DDW洗滌，洗去20％的乙醇、除盡基質(zhì)中的空氣，并能防止下一步中Ni離子沉淀；

②⑩5×柱體積的Charge Buffer（50mM NiSO₄）充電；

③5×柱體積的DDW洗滌，去游離的Ni離子；

④10×柱體積的Binding Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,5mM咪唑，pH8.0）平衡；

⑤上樣（手工上樣，樣品體積應(yīng)根據(jù)目的蛋白的濃度來確定）；

⑥10×柱體積的Binding Buffer洗滌，至無蛋白檢出，用三氯醋酸檢測，收集流出液；

⑦Elution Buffer（20mM Tris-HCl,0.5M NaCl,500－1000mM咪唑，pH8.0）洗脫，每次1ml，應(yīng)呈現(xiàn)正態(tài)分布（兩邊稀，中間濃）；

⑧10×柱體積的Binding Buffer洗滌。此時，即可用于純化同種蛋白，很少需要重新充電。

⑨用20％的乙醇充滿柱子，保存在4℃。

注：同種蛋白純化5～10次后，應(yīng)進行strip和re-charge。

C、柱的清洗與保存（最好每天清洗一次）：

（1）去Ni離子：

①5×柱體積的Strip Buffer（20mMTris-HCl,0.5M NaCl,50mM EDTA，pH7.4）洗滌；

②10×柱體積的DDW洗滌。

（2）去沉淀的蛋白質(zhì)：

①5×柱體積的0.5M NaOH裝滿柱子，靜置0.5～2hr；

②DDW洗滌，至流出液的pH值為7。

（3）保存：20％乙醇洗滌，再加20％乙醇保存于4℃。

D、柱的再生：

當流速很慢、充電后基質(zhì)不變成藍綠色時，應(yīng)進行柱的再生。

① 2×柱體積的6M鹽酸胍洗滌，然后3×柱體積的DDW洗滌；

② 1×柱體積的2％SDS洗滌；

③ 5×柱體積的0.5M NaOH裝滿柱子，靜置0.5～2hr；

④ 5×柱體積的DDW洗滌，然后5×柱體積的100mM EDTA，pH8.0洗滌；

⑤ 3×柱體積的DDW洗滌，然后3×柱體積的20％乙醇洗滌；

⑥ 20％乙醇保存于4℃。

【備注】Ni²⁺親和層析柱純化緩沖液（1×Buffer）：

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