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槲皮素異戊烯基化修飾物清除自由基活性研究

 寒江讀舟 2011-10-21

槲皮素異戊烯基化修飾物清除自由基活性研究

吳麗燕

專 業(yè):食品科學與工程   學 號:2007464111  指導老師:李梅

 

摘要:對槲皮素進行結(jié)構(gòu)修飾,開發(fā)具有更強生物活性的新藥是目前醫(yī)藥研究的重要內(nèi)容。本試驗分別通過Fenton反應、鄰苯三酚自動氧化法和紫外可見分光光度法,對不同濃度槲皮素及其異戊烯基化修飾物清除羥自由基(?OH)、超氧陰離子自由基(O2?-)和二本代苦味酰自由基(DPPH)能力進行比較研究。結(jié)果顯示,對槲皮素進行異戊烯基化修飾后,所得修飾物對三種自由基清除能力較槲皮素顯著增強,平均清除率為分別為56.16%、44.82%87.69%;兩種物質(zhì)對三種自由基體系的清除能力大小依次為DPPH>?OH > O2?-,而且呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。

 

關(guān)鍵詞異戊烯基修飾;槲皮素;自由基;清除

AbstractStructural modification of quercetin, the development of new drugs with greater biological activity is an important part of medical research. In this study, respectively, through the Fenton reaction of pyrogallol auto-oxidation and UV-visible spectrophotometer for different concentrations of quercetin and its prenyl modification scavenging hydroxyl radical (? OH), superoxide anion radical (O2 ? -) and two on behalf of the bitter acid radical (DPPH) capacity were compared. The results showed that quercetin for prenyl modification, the modification from the three free radical scavenging properties of quercetin significantly increased compared with the average clearance rate was 56.16%, 44.82% and 87.69%; two Substances on the free radical scavenging ability of the three order of DPPH> ? OH> O2 ? -, and showed a dose dependent manner.

Key words: prenyl modification; quercetin; free radicals; clear

 

槲皮素及其衍生物是植物界分布最廣的黃酮類化合物,廣泛存在于植物的花、葉、果實中, 也是人類飲食中最主要的生物類黃酮。研究表明,槲皮素具有抗氧化、抗炎、降血壓、抗心律失常、抗血小板凝聚、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性,這些生物活性與其較強的清除自由基能力密切相關(guān)[1-2]。槲皮素可直接清除活性氧自由基,抑制脂質(zhì)過氧化損傷,可顯著提高超氧物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷耽一甘膚過氧化物酶(GSH-Px)的活性和降低丙二醛(MDA)含量,對經(jīng)過運動訓練的大鼠肝組織產(chǎn)生的自由基具有清除效果,并有保護肝組織的作用,可減少運動后因脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的內(nèi)源性自由基對機體的損傷,保護細胞膜的完整性,從而增強抗氧化活性[3]槲皮素還能抑制H2O2引起的人紅細胞溶血和紅細胞脂質(zhì)過氧化作用[4]。槲皮素抗氧化清除自由基的機制可能與以下幾方面有關(guān):①與超氧陰離子絡合而減少氧自由基的產(chǎn)生;②與脂質(zhì)過氧化氫反應抑制脂質(zhì)過氧化過程;③與鐵離子絡合而阻止輕自由基的形成;④抑制醛糖還原酶,減少還原輔酶 11(NADPH)消耗,從而提高機體抗氧化能力[5]

槲皮素之所以具有較強的清除自由基能力,原因之一是其結(jié)構(gòu)中富含酚輕基,這些酚經(jīng)基可提供活潑氫使自由基滅活。由于槲皮素為平面型分子,分子堆砌較緊密,分子間引力較大,不易被溶劑或溶質(zhì)分散,水溶性差,難于吸收、生物利用度低,進而影響其吸收和藥效的發(fā)揮。因此,國內(nèi)外學者對槲皮素的結(jié)構(gòu)進行化學修飾,在槲皮素分子中導入親水性集團,以期增加其溶解度和改善吸收,從而增強其藥理活性作用[6]。目前對于槲皮素的結(jié)構(gòu)修飾的研究多集中槲皮素的金屬配合物的合成和生物活性研究,合成的槲皮素與金屬元素(鋅、鉻、鉬、鈷)的配合物,其抗氧化明顯增強[7]

研究表明,許多化合物的異戊烯基化修飾會帶來一些新的生物活性,尤其表現(xiàn)在抗癌、抗病菌、抗發(fā)炎、抗氧化、抗HIV等方面[8-10]。異戊烯基化的黃酮類化合物作為黃酮類化合物中最獨特的一類,具有多種生物活性,目前已發(fā)現(xiàn)的大約近700個,據(jù)Nikaido.T.等報道,黃酮類化合物中異戊烯基的存在極大的增長了它們的親脂性,這使得化合物分子能夠強烈的親和生物膜,進而可引起相關(guān)生物活性(尤其是抗氧化性)的顯著提高[10]。由此可以推測,在槲皮素分子上引入合適的異戊烯基,對其結(jié)構(gòu)進行異戊烯基修飾,會對槲皮素分子生物活性產(chǎn)生一定的影響。

本研究通過對不同濃度的槲皮素和槲皮素戊烯基化修飾物清除羥基自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基能力的比較,研究其可能存在的協(xié)同作用,為尋找新型、高效、低毒的槲皮素修飾物提供初步的實驗依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗材料與試劑

槲皮素純度為95%,國藥集團化學試劑有限公司;90%異戊烯基溴,國藥集團化學試劑有限公司;丙酮(分析純),成都市科龍化工試劑廠;100%乙醇;DPPHSIGMA公司;30%H2O2、硫酸亞鐵、水楊酸、鄰苯三酚HCl等均為分析純。

1.1.2試驗主要儀器

722可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司);百分之一和天分之一的電子天平(北京賽多麗斯儀器有限公司);HH恒溫水浴鍋(江蘇金壇市中大儀器廠);RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)10-100ul、100-1000ul移液槍。

1.1.3不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物清除自由基的能力

研究不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對不同體系自由基的清除能力。槲皮素設七個濃度,分別是:0.5、1.0、1.52.0、2.5、3.0、3.5mg/ml,用A1-A7表示;槲皮素異戊烯基化修飾物的七個濃度分別用B1-B7表示。

1.1.3.1羥自由基體系

比色法測定Fenton反應生成的?OH的,利用H2O2Fe2 + 混合產(chǎn)生?OH,若在反應體系中加入水楊酸,就能有效地捕捉?OH,并產(chǎn)生有色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在510 nm 處有強吸收。若在此反應體系中加入具有清除?OH 功能的被測物,與水楊酸競爭?OH,從而使有色產(chǎn)物生成量減少。取30支試管編號為A11-A17,A21-A27,A3;B11-B17,B21-B27,B3,。每支試管中加入樣液A、B產(chǎn)品 0.1ml,、9mmol/L  Fe2 +  l mL、9 mmol/L水楊酸乙醇溶液1mL,最后加入9.1mmol/L  H2O2 0.1 mL(啟動Fenton反應)搖勻,在510 nm 測量各濃度下的吸光度為A11-A17B1-B7.。取0.1ml蒸餾水取代9mmol/L 1 Fe2 + 溶液測定吸光度為A21-A27,B21-B27。取0.1蒸餾水分別代替樣液A、B 測吸光度為A3B3

1.1.3.2超氧陰離子自由基體系

采用鄰苯三酚自氧化法測定, 利用O2?-清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325 nm 處的吸收峰受到抑制這一特點, 用紫外分光光度計進行監(jiān)測, 間接測得O2?-生成及O2?-的清除率。取30支試管編號為A11-A17,A21-A27,A3;B11-B17,B21-B27,B3,。每支試管中加入0. 05mmol/ L PH 8. 2 的磷酸鹽酸 緩沖液3. 5 mL 于試管中, 25 預熱20 min,加入0. 1 mmol/ L 鄰苯三酚(用0.01mol/LHCl配成)0. 1 mL, 樣液產(chǎn)品0. 1 mL, 蒸餾水1 mL, 25 水浴準確反應4 min時測定A325B325, 記為A11-A17B11-B17樣品。另取試劑同上,用0.1ml蒸餾水代替鄰苯三酚,測定吸光度記為A21-27B21-B27。再取0.1ml蒸餾水代替樣液A、B測吸光度為A3B3。

1.1.3.3二本代苦味酰自由基(DPPH)體系

比色法測定產(chǎn)品對DPPH的清除作用:取30支試管編號為A11-A17,A21-A27,A3B11-B17,B21-B27,B3,。每支試管中加入樣液產(chǎn)品0.1ml,5mlDPPH –用95%乙醇配成0.0001mol/L,25度恒溫30min,在波長517nm下測定吸光值。其中A11-A175mlDPPH溶液+0.1ml樣液A; A21-A25ml乙醇溶液+0.1ml樣液A,A35mlDPPH溶液+0.1ml蒸餾水。B11-B175mlDPPH溶液+0.1ml樣液B;B21-B275ml乙醇溶液+0.1ml樣液B, 0.1ml蒸餾水代替樣液測吸光度為A3B3。

1.2試驗方法

1.2.1槲皮素戊烯基化修飾物的制備

1.2.1.1合成

0.255g槲皮素→加入50ml丙酮中溶解,+無水碳酸鉀(丙酮溶液的1/4),+相關(guān)比例105ul的異戊烯基溴→加熱回流,(溫度60)水浴回流8h。

合成路線如下圖:

 1.2.1.2純化

過濾去碳酸鉀后用丙酮潤洗,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),蒸干。用乙醚(乙酸乙酯,氯仿)萃取3-水浴鍋揮干(攪拌)-少量甲醇溶解-加入水(10ml-乙醚(乙酸乙酯,氯仿)萃取3-揮干-高效液相色譜(HPLC)分析純度。

1.2.2自由基清除率P(%)的計算

以上各體系測定所得的吸光度為A1、A2A2代入以下公式,計算不同濃度的槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對不同體系自由基的清除能力。

1.2.3數(shù)據(jù)的處理和統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)利用Excel進行整理,利用DPS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。

2試驗結(jié)果與分析

2.1槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對自由基的清除能力比較

2.1.1不同濃度槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對羥自由基的清除能力

羥基自由基是最活潑的自由基,也是毒性最大的自由基,它可與活細胞中的任何分子發(fā)生反應而造成損害,且反應速度快,能殺死紅細胞,降解DNA、細胞膜和多糖化合物,許多由它所致有害效應在加入羥自由基的清除劑后會明顯降低。所以羥自由基清除率是評價物質(zhì)對自由基的清除效果的最常用的指標。

1 不同濃度的槲皮素及其異戊烯基化修飾物對羥自由基的清除率

試驗結(jié)果表明(見圖1):槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物均有較強的清除羥自由基的能力,當濃度從0.05mg/mL增加到0.3mg/mL,羥自由基清除率隨樣液濃度增加而增加,差異達到顯著或極顯著水平,濃度再增加至0.35mg/mL,羥自由基清除率繼續(xù)增加,但差異不顯著。相比,槲皮素異戊烯基化修飾物清除能力較槲皮素有明顯的提高,且隨濃度的增加,羥自由基清除率的增幅比槲皮素更大,當樣液濃度達到0.35mg/mL時槲皮素異戊烯基化修飾物對羥自由基的清除率達到75.11%遠高于槲皮素的57.13%

2.1.2不同濃度槲皮素異戊烯基化修飾物對超氧陰離子自由基的清除能力

生物體內(nèi)氧化還原反應中,大致有2%-5%的氧會產(chǎn)生超氧陰離子自由基,超氧陰離子自由基的毒性是機體發(fā)生氧中毒的主要原因,表現(xiàn)在使核酸鏈斷裂、多糖解聚和不飽和脂肪酸過氧化作用,進而造成遺傳突變、膜損傷、酶系失活、線粒體氧化磷酸化作用改變等一系列變化。

2 不同濃度的槲皮素及其異戊烯基化修飾物對超氧陰離子的清除率

對槲皮素及其異戊烯基化修飾物的超氧陰離子清除能力的試驗結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果表明:槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物均有一定的清除?OH自由基的能力,隨濃度的增加,槲皮素及其異戊烯基化修飾物清除?OH自由基的能力逐漸增強,差異達到顯著或極顯著水平,與槲皮素相比,低濃度時,槲皮素異戊烯基化修飾物清除?OH自由基的能力稍強,但差異不顯著,但隨濃度的增加,修飾物清除?OH自由基的能力增加更快,當濃度達到0.35mg/ml時,槲皮素異戊烯基化修飾物清除超氧陰離子自由基效率達到69.11%,顯著高于槲皮素的清除率為48.98%。提示更高濃度的槲皮素異戊烯基化修飾物可能具有更強的清除超氧陰離子,具體情形如何需進一步的試驗驗證。

2.1.3不同濃度槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對二本代苦味酰自由基(DPPH)的清除能力

DPPH 在有機溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基,在517nm 處對光有較強的吸收,當有自由基消除劑存在時,其孤電子被配對,吸收消失或減弱。因此,可通過檢測自由基的清除情況,從而評價某物質(zhì)的氧化能力。自由基清除率越大,物質(zhì)的抗氧化能力越強。

3 不同濃度的槲皮素及其異戊烯基化修飾物對DPPH自由基清除率

試驗結(jié)果表明(圖3):槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物均有較強的清除DPPH自由基的能力,樣液濃度為0.05mg/ml時,槲皮素的清除率已經(jīng)達到68.8%,且隨樣液濃度的增加而增加,相比,槲皮素異戊烯基化修飾物的清除DPPH自由基的能力更強,樣液濃度為0.05mg/ml時,修飾物的DPPH清除率就高達75.4%。當樣液濃度達0. 35 mg/ml,清除率已高達93.77%,明顯高于槲皮素的清除率72.61%。但隨樣液濃度的增加,兩種物質(zhì)對DPPH的清除率增幅都不明顯,尤其是在濃度大于0.20mg/ml,兩種物質(zhì)清除DPPH的能力隨濃度的增加幅度都不大,差異性不顯著。

2.1.4槲皮素及其異戊烯基化修飾物自由基清除率的比較

槲皮素及其異戊烯基化修飾物對不同體系自由基清除率見表1:槲皮素分子結(jié)構(gòu)符合有效酚羥基理論,具有極強的自由基清除能力,研究結(jié)果表明,槲皮素對羥基自由基、超氧陰離子和DPPH的清除率分別是41.80%31.56%72.99%,對其結(jié)構(gòu)進行異戊烯基化修飾后得到的修飾物的清除自由基能力進一步增強,均與對照差異達到極顯著水平,尤其是對DPPH的清除率高達87.69%

1 槲皮素及槲皮素異戊烯基化修飾物對不同體系自由基清除率

 

羥基自由基

超氧陰離子

DPPH

異戊烯基化修飾物

56.16 16.69aA

44.82 18.30aA

87.69 6.64aA

槲皮素

41.80 13.11bB

31.56 10.87bB

72.99 2.67bB

3 討論

3.1槲皮素具有較強的體外抗氧化活性,對其結(jié)構(gòu)進行異戊烯基化修飾,所得的異戊烯基化修飾物的體外抗氧化活性會顯著增強,表現(xiàn)為對羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除率較槲皮素極顯著增加。

3.2 槲皮素及其槲皮素異戊烯基化修飾物對三種自由基體系的清除率存在差異,清除能力大小依次是DPPH自由基>羥基自由基>超氧陰離子自由基。槲皮素及其修飾物對超氧陰離子自由基清除能力最低,但試驗最高濃度,清除率仍在持續(xù)增加,差異達到顯著水平,由此提示,更高的濃度的槲皮素及其異戊烯基化修飾物可能會對超氧陰離子自由基的清除能力更強。

3.3 供試濃度范圍內(nèi),隨濃度的增加,槲皮素及其異戊烯基化修飾物清除羥自由基、超氧陰離子自由基和DPPH自由基的能力都不斷增加,但槲皮素異戊烯基化修飾物的增幅較槲皮素更大,表現(xiàn)為提高濃度,清除自由基的能力增加更快。

4 結(jié)論

槲皮素具有廣泛的生物活性,對其進行結(jié)構(gòu)修飾,合成出具有更優(yōu)越生物活性的化合物,對于充分開發(fā)和利用這一類豐富的天然藥物資源,為人類的健康和醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展具有重要的意義。本試驗僅對槲皮素及其異戊烯基化修飾物的體外抗氧化作用進行試驗研究,而槲皮素具有廣泛的生化活性,對其進行異戊烯基化修飾后,其抗炎、降血壓、抗心律失常、抗血小板凝聚、抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化等多種生物活性是否也會如抗氧化性一樣得以提高,需試驗進一步的研究。

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