Western熒光檢測取決于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—顯影和定影效率這一系統(tǒng)。我的經(jīng)歷認為確保萬無一失的做法是如果看到熒光則壓10~30s，看不到則同時壓兩張，10~30min洗一張，如果無則再補一張,1h后洗。再無，則壓過夜。共3張片，根據(jù)每次結(jié)果調(diào)整。

其中兩張片子的壓法如下描述: 先剪一張比膜長2~3厘米的片子（以供貼膠帶），然后剪2片細小透明膠帶貼到片子的左右兩邊（貼時膠帶留一半用于粘到封口膜上），然后將片子壓到膜上，并使透明膠帶留出的一半粘到封口膜上。這樣就固定了第一張膠片，就不會因為放、取第二張膠片而使第一張移動了。然后放第二張膠片，與第一張片子貼在一起就行，注意片子要干燥，壓片前用紙擦干封口膜，以避免被底物液體污染導(dǎo)致與下面一張粘在一起。取時用手輕輕拂過就可以把上面片子與下面一張錯開了，不要用手摳，否則下面一張也移動了。 在洗下面一張片子時一定要取掉粘在片子上的膠帶，否則在膠帶的地方會影響顯影。熒光經(jīng)過下面一張膠片會稍微有些衰減，所以下面一張膠片感光稍微比上面一張強一些。

*注1 其具體問題有二：一是背景較高,二是沒有條帶.形成機制為條帶處HRP很快將底物耗竭，則不發(fā)光不使膠片感光而為白色,周圍因背景HRP較低而持續(xù)發(fā)光一段時間使膠片感光為黑色。這種常見于高濃度抗體并且封閉/洗脫不好的情況下。如果沒有背景則就是原因3的現(xiàn)象。在暗室可以看到條帶周圍熒光而條帶處為暗。如是則要么通過降低抗體解決，要么動作迅速早期未耗竭底物時壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時間不能解決問題。也可以過一段時間鼿RP稍減后重加底物迅速壓片。還有另外一種反影現(xiàn)象就是壓出條帶粗大模糊，但條帶中心是空的白色，原因和上面的一樣，主要是條帶中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的熒光帶，但與上面的區(qū)別主要在于特異性要好一些，若繼續(xù)發(fā)展則就是原因3的現(xiàn)象。其分析和解決同上。

*注2 其原因主要是HRP太高超速催化底物生成的產(chǎn)物使膜發(fā)黃,壓出的片子可以是正常的或和原因1或原因3的現(xiàn)象同時存在，只是一種現(xiàn)象，在壓過的膜可以看出來（只在加底物后一段時間出現(xiàn)，幾小時后可能還會消退，有時甚至剛加底物1~2min就可以看出來，所以要把握時機）。如果沒有達到原因1和原因3的程度，那么這種情況一定能夠看到很強的熒光，是一種良好的狀態(tài),是我們所期盼的。如果壓出正常片子而不出現(xiàn)原因1和原因3的現(xiàn)象,可以不予處理。但因為熒光太強極易導(dǎo)致條帶增粗變大，所以也可以不稀釋抗體而通過調(diào)整壓片時間來解決，一般壓10s~30s，甚至可以3~5s，即時根據(jù)結(jié)果在暗室調(diào)整,熒光持續(xù)時間長的話都可連續(xù)壓十數(shù)張片子而效果良好。但也有這種情況，就是由于HRP過強無論怎么減少壓片時間條帶都依然粗大（如果時間過短如<3s則可因感光不足導(dǎo)致條帶太淡，這樣就不可取了，但依然是粗大的、非條帶的本來面目），那么如果想獲得漂亮條帶則必須通過降低抗體濃度（減少上樣量很不穩(wěn)定且能力有限，故很少使用）來解決。原因1和3若如是則解決也是一樣的。

*注3 這是與1類似但抗體特異性較好時的一種表現(xiàn)，經(jīng)常與下面的原因4、5、6混淆，特別需要注意。主要出現(xiàn)在HRP極高的情況下，來不及壓片就已耗竭底物，往往伴有原因2的現(xiàn)象。可通過加入底物后迅速進入暗室觀察熒光確定，也可以根據(jù)原因2的現(xiàn)象確定，以區(qū)分于原因4、5、6。除非動作迅速早期未耗竭底物時壓片，否則一旦耗竭通過減少壓片時間不能解決問題。也可以過一段時間待HRP稍減后TBST簡單洗膜重新加底物壓片。這種情況下一/二抗稀釋可高達10倍而依然熒光明顯。

*注4 提高抗體上樣量以及下述的使用敏感底物/延長壓片時間比較簡單,在此不贅述，只提醒一下隨抗體濃度增高背景和非特異性可能會增加。關(guān)于上樣量的極限在此發(fā)表我的看法：對于裂解的混合蛋白以上樣孔底面積(平方毫米)乘30ug作為極限上樣量，而落實到每一個具體條帶（同一分子量的所有蛋白或僅做單一蛋白電泳），則以0.3ug/平方毫米底面積作為極限上樣量。(見《抗體技術(shù)實驗指南》的免疫印跡一章)，超過此量可能會導(dǎo)致條帶變形。條帶信號弱可以通過加大上樣量/提高抗體濃度/使用敏感底物/延長壓片時間解決。但實際上樣量的極限并不以我說的極限上樣量為準，因為這個極限上樣量是確保所有分子量的條帶都跑的很漂亮的極限,而上樣超量的表現(xiàn)是隨量的加大變形的條帶由低分子量逐漸往高分子量延伸。所以western極限上樣量的真正操作標準是以目的條帶不變形作為極限。比如對于150kd，完全可以超出我所說的極限上樣量的2倍而不變形（此時中低分子量條帶早已融合或擠為棒槌形了）

*注5 對于非小分子量尤其是大分子量（>100kd）蛋白而言，一般不會出現(xiàn)過轉(zhuǎn)情況，轉(zhuǎn)膜不充分是主要原因，增加轉(zhuǎn)膜力度無非是加大電壓/電流，延長時間。但對于小分子蛋白（<30kd就要注意了，<15kd尤其要當心）很可能出現(xiàn)過轉(zhuǎn)，麗春紅染膜或觀察marker有沒有穿膜可以確認，沒有麗春紅也可以考染轉(zhuǎn)膜后的膠，如果是一片空白，則要小心了，可適當降低轉(zhuǎn)膜力度。對于低分子量一般轉(zhuǎn)膜液不要加SDS以防過轉(zhuǎn)，《抗體技術(shù)實驗指南》提供的針對中低分子量的濕轉(zhuǎn)緩與高分子量的相比也是不含SDS的。

*注6 測試HRP或底物活性：于暗室EP管加底物A、B液各500ul，加入1ul HRP偶聯(lián)二抗，若底物立即發(fā)出藍光并于隨后數(shù)分鐘內(nèi)消失說明HRP和底物尚好。此外試劑公司還開發(fā)一些超級底物，其敏感度可達到pg級，但價格昂貴，對某些表達較低的蛋白效果會好些，而且也超級省抗體（其推薦抗體稀釋比高達1:10,000以上）。我用的是敏感度為ng級的底物，大部分western都還可以，pg級的還放在手里，沒舍得用。