第二節(jié)  細(xì)菌的生長(zhǎng)與培養(yǎng)基

培養(yǎng)基(Culture Medium)是微生物生長(zhǎng)、分離鑒別的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)。培養(yǎng)基是醫(yī)學(xué)衛(wèi)生研究、醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)、臨床細(xì)菌檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查及生物制品制造等行業(yè)的基礎(chǔ)。培養(yǎng)基在微生物領(lǐng)域中發(fā)揮著重要的作用。

    目前，除麻風(fēng)桿菌、梅素螺旋體等少數(shù)菌種外，絕大多數(shù)細(xì)菌都可以在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，細(xì)菌培養(yǎng)必須滿足不同細(xì)菌的生長(zhǎng)條件。

一、細(xì)菌生長(zhǎng)的一般條件

    細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的必要條件是：

    1.充足的營(yíng)養(yǎng)。這是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖所需的原料和能量的來源。

    2．適宜的酸堿度。pH7.2~7.6條件下，多數(shù)細(xì)菌體內(nèi)酶的活性最強(qiáng)，有利于新陳代謝；少數(shù)菌必須在偏酸或偏堿的條件下生長(zhǎng)，如結(jié)核桿菌為pH6.4~7.0，乳酸桿菌為pH5.5，霍亂弧菌在pH8.8時(shí)生長(zhǎng)最好。

    3．合適的溫度。通常37℃適合病原菌生長(zhǎng)，但各類細(xì)菌對(duì)溫度的要求差異較大，如鼠疫桿菌和小腸結(jié)腸耶爾森菌是28℃，空腸彎曲菌是42℃。

    4．必要的氣體環(huán)境。根據(jù)細(xì)菌對(duì)氧需求的不同可將細(xì)菌分成四類：

    (1)專性需氧菌(obligate aerobe)。此類細(xì)菌具有完善的呼吸酶系統(tǒng)，需要分子氧作為受氫體完成有氧呼吸，在無游離氧的環(huán)境中不能生長(zhǎng)。如結(jié)核桿菌、霍亂弧菌等均屬此類。

    (2)微需氧菌(microaerophilic bacterium)。此類細(xì)菌在低氧壓下(5%~10%)生長(zhǎng)最好，當(dāng)氧壓超過10%時(shí)對(duì)其有抑制作用。如空腸彎曲菌、幽門螺桿菌等。

    (3)兼性厭氧菌(facultative  anaerobe)。兼有有氧呼吸和無氧酵解兩種功能，不論在有氧或無氧環(huán)境都能生長(zhǎng)，但以有氧時(shí)生長(zhǎng)較好。大多數(shù)病原菌屬此類。

    (4)專性厭氧菌（obligate anaerobe）。此類細(xì)菌缺乏完善的呼吸系統(tǒng)，只能在無氧環(huán)境中進(jìn)行酵解。在有游離氧條件下，不能利用分子氧，而且還遭受分子氧的毒害，甚至死亡。如破傷風(fēng)桿菌、脆弱擬桿菌等屬此類。

二、培養(yǎng)基的分類

    （一）按培養(yǎng)基用途分

    1．營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基。含微生物生長(zhǎng)繁殖所需基本營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)基常用以牛肉浸粉、蛋白胨、氯化鈉為基礎(chǔ)，也可增加所需的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如血液等。瓊脂是培養(yǎng)基中常用的凝固劑，以支撐細(xì)菌的生長(zhǎng)形態(tài)形成菌落，它對(duì)細(xì)菌無營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

  2．增菌運(yùn)送培養(yǎng)基。將可疑標(biāo)本接種于運(yùn)送培養(yǎng)基中。增菌培養(yǎng)基為液體，是擴(kuò)大培養(yǎng)的手段，也是細(xì)菌生化反應(yīng)的主要培養(yǎng)方法。

  3．選擇鑒別培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入指示劑或化學(xué)物質(zhì)，抑制某些細(xì)菌生長(zhǎng)而有助于需要的細(xì)菌生長(zhǎng)，或通過指示劑顏色變化分離鑒別細(xì)菌。

  4．特殊培養(yǎng)基。包括厭氧培養(yǎng)基及其他（抗生素效價(jià)測(cè)定和藥敏試驗(yàn)）培養(yǎng)基。

    （二）按培養(yǎng)基物理性狀分

    1．液體培養(yǎng)基。將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)溶解于液體中，調(diào)整pH滅菌后即為液體培養(yǎng)基。常用于細(xì)菌增菌或觀察細(xì)菌的生化反應(yīng)。

    2．固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中加入13~15g/L瓊脂，溶化后凝固成固體培養(yǎng)基。制成平皿，用于分離培養(yǎng)、活菌計(jì)數(shù)、選擇培養(yǎng)、藥敏試驗(yàn)。固體培養(yǎng)基可在試管中制成斜面用于菌種傳代和短期保存。

    3．半固體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基中加入2~5g／L瓊脂。用于細(xì)菌動(dòng)力觀察和菌種保存

三、致病性細(xì)菌的特殊生長(zhǎng)條件

    由于細(xì)菌種屬不同，營(yíng)養(yǎng)需求不同，按細(xì)菌外形可分為球菌、桿菌和螺形菌?，F(xiàn)將所需的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)述如下。

    1．球菌( coccus)

    呈圓球形、矛頭狀或腎形，單個(gè)球菌直徑約為0.5~3.0um。繁殖時(shí)按細(xì)菌排列方式不同可分雙球菌、鏈球菌、四聯(lián)球菌、八疊球菌和葡萄球菌。常見球菌包括葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腦膜炎球菌及淋球菌等。它們可引起人類化膿性感染，又稱為化膿性球菌。在血瓊脂平板上，金黃色葡萄球菌呈現(xiàn)透明溶血環(huán)。表皮葡萄球菌等在血平板上無溶血現(xiàn)象。鏈球菌需要在含血液或血清培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。根據(jù)菌落周圍溶血環(huán)特點(diǎn)分為三類：不溶血、形成完全透明溶血環(huán)（β溶血）和草綠色溶血環(huán)（α溶血）。肺炎鏈球菌在含血液培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落周圍形成草綠色溶血環(huán)。奈瑟菌屬營(yíng)養(yǎng)要求高，常用巧克力色血瓊脂平板分離培養(yǎng)，因通過血液加熱后可釋放出大量的x、v因子，供細(xì)菌生長(zhǎng)需要。

  2.桿菌( bacillus)

多呈直桿狀，少有微微彎曲。桿菌的長(zhǎng)短、粗細(xì)和彎度隨菌種不同而異。桿菌的直徑約為0.2 - 2um，長(zhǎng)短0.5~20um不等。桿菌菌體兩端平齊，如炭疽桿菌。兩端呈尖狀如梭桿菌，其中艱難梭菌生長(zhǎng)條件苛刻，需加血嚴(yán)格厭氧培養(yǎng)。也有一端膨大呈棒狀，如白喉?xiàng)U菌在呂氏血清培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，形態(tài)最典型，呈白色，圓型凸起，光滑菌落。亞碲酸鉀血瓊脂上菌落呈黑色，常作為本菌的篩選鑒別。這是因?yàn)閬嗧谒徕浤苓M(jìn)入白喉?xiàng)U菌菌體被還原成黑色金屬碲。亞碲酸鉀可抑制雜菌生長(zhǎng)，而白喉?xiàng)U菌不受影響。菌體兩端呈分枝狀為分枝桿菌，如結(jié)核分枝桿菌專性需氧，最適pH6.4~7.0。營(yíng)養(yǎng)要求高，生長(zhǎng)緩慢。常用L-J (Lo-wenstein - Jensen)培養(yǎng)基，內(nèi)含蛋黃、甘油、馬鈴薯、天門冬素、無機(jī)鹽和孔雀綠?？兹妇G為選擇性抑制劑，可阻止腐敗菌生長(zhǎng)。培養(yǎng)時(shí)間需8天以上至8周。菌落特點(diǎn)為干燥、粗糙、質(zhì)硬、乳白色或乳酪色。

    腸桿菌屬是寄生在人或動(dòng)物腸道中一大群革蘭陰性桿菌。多數(shù)有鞭毛，需氧或兼性厭氧。營(yíng)養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。但腸桿菌屬生化反應(yīng)活躍，能分解多種糖類、蛋白質(zhì)形成不同的代謝產(chǎn)物。常見的有大腸埃希茵、沙門菌和志賀菌，分解糖屬發(fā)酵反應(yīng)。

    3．螺形菌

    螺菌( spiral bacterium)菌體彎曲。根據(jù)彎曲個(gè)數(shù)分為只有一個(gè)彎曲的弧菌（vihrio）和數(shù)個(gè)彎曲的螺菌( spirillum)?；【鷮僦校魜y弧菌營(yíng)養(yǎng)要求不高，耐堿不耐酸，在pH8.8—9.0的堿性蛋白胨水或堿性瓊脂平板上生長(zhǎng)良好?；魜y弧菌和擬態(tài)弧菌可在無鹽胨水中生長(zhǎng)。副溶血性弧菌是一種嗜鹽弧菌，在含3%—4%NaCl培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。目前常用TCBS瓊脂培養(yǎng)基分離霍亂弧苗，該培養(yǎng)基含有硫代硫酸鹽、枸櫞酸鹽、膽鹽及蔗糖，可選擇性地抑制其他腸道菌屬，有利于弧菌生長(zhǎng)?；魜y弧菌可分解蔗糖呈黃色菌落。副溶血性弧菌則呈藍(lán)綠色。

    彎曲菌是一類呈逗號(hào)或S形革蘭陰性菌。需要在加血培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)條件高，需含5%氧氣，10%二氧化碳，85%氮?dú)庵信囵B(yǎng)。使人體致病的菌為空腸彎曲茼。最常見的螺桿菌是幽門螺桿菌( Hp)。37℃生長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)基中需加血液、血清，常引起人胃及十二指腸潰瘍。

    細(xì)菌的大小、形態(tài)和細(xì)菌細(xì)胞排列是細(xì)菌的重要生理特征之一。一般而言，在適宜的生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)8～18小時(shí)，細(xì)菌的生理特征最為典型，宜選擇細(xì)菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期觀察細(xì)菌形態(tài)和大小。

    通過標(biāo)本的涂片及染色，能觀察細(xì)菌的形態(tài)、大小、排列、染色特性，以及莢膜、鞭毛、芽胞、異染顆粒等結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)菌的初步識(shí)別或診斷。

    對(duì)細(xì)菌進(jìn)行染色檢查，應(yīng)先制作細(xì)菌涂片。臨床標(biāo)本可直接涂抹于潔凈的載玻片上；液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌取培養(yǎng)液直接涂于載玻片上；對(duì)于固體培養(yǎng)基上的菌落，則需在載玻片進(jìn)行固定，以殺死細(xì)菌，固定細(xì)胞質(zhì)和結(jié)構(gòu)，改變細(xì)菌對(duì)染色的通透性。一般用火焰固定，有時(shí)根據(jù)需要用冰凍干燥法或化學(xué)方法，如醇、酸、氯化高汞等固定。