第二代測序技術(shù)

--以Illumina/Solexa Genome Analyzer 為例

1.概述

      DNA測序（DNA sequencing）作為一種重要的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，在生物學(xué)研究中有著廣泛的應(yīng)用。早在DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)（Watson and Crick,1953)被發(fā)現(xiàn)后不久就有人報(bào)道過DNA測序技術(shù)，但是當(dāng)時(shí)的操作流程復(fù)雜，沒能形成規(guī)模。隨后在1977年Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年A.M.Maxam和W.Gilbert發(fā)明了化學(xué)降解法。Sanger法因?yàn)榧群啽阌挚焖?，并?jīng)過后續(xù)的不斷改良，成為了迄今為止DNA測序的主流。然而隨著科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的Sanger測序已經(jīng)不能完全滿足研究的需要，對模式生物進(jìn)行基因組重測序以及對一些非模式生物的基因組測序，都需要費(fèi)用更低、通量更高、速度更快的測序技術(shù)，第二代測序技術(shù)（Next-generation sequencing)應(yīng)運(yùn)而生。第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序（Sequencing by Synthesis)，即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺(tái)主要包括Roche/454 FLX、Illumina/Solexa Genome Analyzer和Applied Biosystems SOLID system。這三個(gè)技術(shù)平臺(tái)各有優(yōu)點(diǎn)，454 FLX的測序片段比較長，高質(zhì)量的讀長（read）能達(dá)到400bp；Solexa測序性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%，而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%，是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。雖然第二代測序技術(shù)的工作一般都由專業(yè)的商業(yè)公司來完成，但是了解測序原理、操作流程等會(huì)對后續(xù)的數(shù)據(jù)分析有很重要的作用，下文將以Illumina/Solexa Genome Analyzer 測序?yàn)槔?，簡述第二代測序技術(shù)的基本原理、操作流程等方面。

2.基本原理

      Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成變測序。在Sanger等測序方法的基礎(chǔ)上，通過技術(shù)創(chuàng)新，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測DNA的序列信息。

3.操作流程

1）測序文庫的構(gòu)建（Library Construction）

      首先準(zhǔn)備基因組DNA（雖然測序公司要求樣品量要達(dá)到200ng，但是Gnome Analyzer系統(tǒng)所需的樣品量可低至100ng,能應(yīng)用在很多樣品有限的實(shí)驗(yàn)中），然后將DNA隨機(jī)片段化成幾百堿基或更短的小片段，并在兩頭加上特定的接頭（Adaptor）。如果是轉(zhuǎn)錄組測序，則文庫的構(gòu)建要相對麻煩些，RNA片段化之后需反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭。片段的大?。?span lang=EN-US XML:LANG="EN-US">Insert size）對于后面的數(shù)據(jù)分析有影響，可根據(jù)需要來選擇。對于基因組測序來說，通常會(huì)選擇幾種不同的insert size，以便在組裝（Assembly）的時(shí)候獲得更多的信息。

2）錨定橋接（Surface Attachment and Bridge Amplification）

      Solexa測序的反應(yīng)在叫做flow cell的玻璃管中進(jìn)行，flow cell又被細(xì)分成8個(gè)Lane，每個(gè)Lane的內(nèi)表面有無數(shù)的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈后與測序通道上的接頭引物結(jié)合形成橋狀結(jié)構(gòu)，以供后續(xù)的預(yù)擴(kuò)增使用。

3）預(yù)擴(kuò)增（Denaturation and Complete Amplification）

      添加未標(biāo)記的dNTP 和普通Taq 酶進(jìn)行固相橋式PCR 擴(kuò)增，單鏈橋型待測片段被擴(kuò)增成為雙鏈橋型片段。通過變性，釋放出互補(bǔ)的單鏈，錨定到附近的固相表面。通過不斷循環(huán)，將會(huì)在Flow cell 的固相表面上獲得上百萬條成簇分布的雙鏈待測片段。

4）單堿基延伸測序（Single Base Extension and Sequencing）

      在測序的flow  cell中加入四種熒光標(biāo)記的dNTP 、DNA 聚合酶以及接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，在每一個(gè)測序簇延伸互補(bǔ)鏈時(shí)，每加入一個(gè)被熒光標(biāo)記的dNTP就能釋放出相對應(yīng)的熒光，測序儀通過捕獲熒光信號(hào)，并通過計(jì)算機(jī)軟件將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為測序峰，從而獲得待測片段的序列信息。從熒光信號(hào)獲取待測片段的序列信息的過程叫做Base Calling，Illumina公司Base Calling所用的軟件是Illumina’s Genome Analyzer Sequencing Control Software  and Pipeline Analysis Software。讀長會(huì)受到多個(gè)引起信號(hào)衰減的因素所影響，如熒光標(biāo)記的不完全切割。隨著讀長的增加，錯(cuò)誤率也會(huì)隨之上升。

5）數(shù)據(jù)分析（Data Analyzing）

      這一步嚴(yán)格來講不能算作測序操作流程的一部分，但是只有通過這一步前面的工作才顯得有意義。測序得到的原始數(shù)據(jù)是長度只有幾十個(gè)堿基的序列，要通過生物信息學(xué)工具將這些短的序列組裝成長的Contigs甚至是整個(gè)基因組的框架，或者把這些序列比對到已有的基因組或者相近物種基因組序列上，并進(jìn)一步分析得到有生物學(xué)意義的結(jié)果。

（注：圖片引自Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402）

4.討論

      目前Solexa測序的讀長能達(dá)到75bp，這個(gè)大小比傳統(tǒng)的Sanger測序要短得多，也比Applied  Biosystems 公司的SOLID測序要短，但是Solexa測序的優(yōu)勢是能夠獲得海量的數(shù)據(jù)，并且價(jià)格低廉，按相同的數(shù)據(jù)量來算，Solexa測序要比其他測序技術(shù)便宜很多。75bp的長度肯定是不適合直接用來分析的，測序得到的reads需要拼接之后才能有實(shí)際的用途，這就要求有強(qiáng)大的生物信息學(xué)分析能力作為支撐。

      和傳統(tǒng)的測序技術(shù)相比，Solexa測序的錯(cuò)誤率也相對較高，并且測序錯(cuò)誤傾向于分布在read后面的堿基中，如何區(qū)分測序錯(cuò)誤和真正的DNA多態(tài)性也是一個(gè)大問題。

      盡管新一代測序技術(shù)還不盡如人意，但是它還是有著廣泛的應(yīng)用。目前一些模式生物的全基因組重測序、非模式生物的全基因組測序以及一些生物的轉(zhuǎn)錄組測序都采用了新一代測序技術(shù)，比如說前不久剛發(fā)表的熊貓的全基因組(Ruiqian Li et al,2009)測序就是用Solexa測序技術(shù)完成的。

5.參考文獻(xiàn)

(1)Elaine R. Mardis (2008) Next-Generation DNA Sequencing Methods Annu. Rev. Genomics Hum. Genet. 9:387–402

(2)Jay Shendure,  Hanlee Ji (2008) Next-generation DNA sequencing. nature biotechnology 6:1135-1145

(3)Stephan C Schuster (2008) Next-generation sequencing transforms today’s biology. Nature Methods 5:16-18

(4)Zhou DG, Zhao QG, Fu CG et al (2008) The Next Generation Sequencing and its Effect on the Rice Molecular Design Breeding. Molecular Plant Breeding  6: 619-630

(5)http://www./newsf/2008-10/20081023145504.htm